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核抽出（ダウンスホモジナイザー） 削除/引用 No.6285-9 - 2017/09/12 (火) 09:31:07 - あべし 回答ありがとうございます。 ダウンス式ホモジナイザーの使用方法については 再度、知見を得るためいろいろ調べてみたいと思います。 一つだけお聞きしたいことがあります。 細胞を粉砕する前に懸濁するLysis Buffer （自分はキットに入っている Lysis Buffer:1ml + 100 mM PMSF:1μl + PIC 1μlを使用しています） そのLysis Buffer培養細胞数（1500万個）に対して多いと考えていますが この割合は常識的な範囲なのでしょうか。 使用する細胞によっていろいろと条件は異なると思いますが、 皆さまは、細胞数とLysis Bufferの量をどのような比で行っているのか 教えていただきたいです。 もしくは、調べることができるサイトをご教授いただけると幸いです。

ダウンス式ホモジナイザー 削除/引用 No.6285-8 - 2017/09/11 (月) 13:25:07 - ema 10stroke ペストルの使い方は正しいですか？液体のなかを上下にちゃぷちゃぷするのではなく壁面にこすりつけながら上下します。

(無題) 削除/引用 No.6285-7 - 2017/09/07 (木) 14:09:12 - おお 核がでないとか書いてますけど、どんな状況だかさっぱりわかりません。おそらく細胞膜が簡単に溶けてクロマチンも可溶化するぐらいの界面活性剤がLysisバッファーに入っているだろうと思います。ただしクロスリンクをしていれば可溶化しにくくなったデブリも結構出てくるかもしれませんが、それは固定の条件を調整するか、超音波を使って分散させるとかすればいいのじゃないでしょうか。Lysisバッファー、ホモジナイズ後、遠心して分けたデブリに更にLysisバッファーを加え再溶出するという手も取れなくもないです。 ただ固定をしない方法でやっているならちょっと違うアプローチのほうがいいかもしれません・

核抽出（ダウンスホモジナイザー） 削除/引用 No.6285-6 - 2017/09/07 (木) 10:03:24 - あべし 皆さま回答ありがとうございます。 　使用しているキットはactive motif社の 　Chip-it Express Enzymatic で 　磁気ビーズを用いたchip assay キットです。 　使用しているホモジナイザーはWHEATON社の 　ダウンス式ホモジナイザーで 間隔精度：微調整用　0.001”〜0.003”（0.025〜0.076 mm） 　　　　　粗調整用　0.0035”〜0.0055”（0.089〜0.14 mm） 　　　　です。容量は1mlです。 　操作は1500万個の培養細胞をホルムアルデヒドで固定して。 　細胞を回収し。その後1mlのLysis Bufferに懸濁した後、30min静置し 　ダウンス式ホモジナイザーで核抽出を行います。 　その後、核抽出ができているか、顕微鏡で観察するのですが、 　何回やっても （プロトコールでは10strokeとありますが100回以上行いました） 　30％くらいしか核が出ず、何かほかに問題があるのではということになりました。 　考えているのは、細胞数にたいして、Lysis Bufferが過量なのでは 　と思い、質問させていただきました。 　また培養細胞をもちいてChip assayを行っている方はどのような 　方法をとっているのかや操作上気を付けていることがあれば教えて 　いただきたいです。不躾な質問ですみませんがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.6285-5 - 2017/09/07 (木) 02:44:55 - おお Carefully aspirate off supernatant and resuspend the pellet in ChIP lysis buffer (750 μL per 1x107 cells) and incubate for 10 min on ice. www.abcam.com/protocols/cross-linking-chromatin-immunoprecipitation-x-chip-protocol Resuspend the cell pellet in 500 μL of Lysis Buffer per 5 x 106 cells. Pipette up and down to resuspend the cells, and incubate on ice for 10 minutes (keep samples on ice from this step forward). www.rndsystems.com/resources/protocols/chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol Lyse cells from one plate (10–15 cm in diameter) with 1 ml IP buffer containing protease inhibitors (and phosphatase inhibitors if needed),.. www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.27.html

(無題) 削除/引用 No.6285-4 - 2017/09/07 (木) 01:57:13 - み ChIPだから細胞を固定、ｸﾞﾘｼﾝなどで中和、その後に抽出操作してるのかな？ 細かい工程とﾊﾞｯﾌｧｰ組成、ﾎﾓｼﾞﾅｲｻﾞｰとは具体的に何を使用してるか。 何がどうなったら上手く行っていると判断できるのか。 最終目的の検出系がPCR、マイクロアレイ、次世代シーケンスならｿﾆｹｰｼｮﾝか酵素処理でDNAを断片化しないといけないと思うけど、その辺も書かないとね。

(無題) 削除/引用 No.6285-3 - 2017/09/07 (木) 00:52:40 - wsxdbghんjmk、l キットを使用しているならば、メーカーに相談するのがいいです。すくなくとも２よりは有用な回答がもらえるとおもいます。核の分離やクロマチンの抽出はKitのカバーする範囲では無いかもしれませんが、CHIPassayの実験の一部なので、いろいろな基礎データやノウハウがあるとおもいますし、そのkitにあった適切な条件というのもあるとおもうので。

(無題) 削除/引用 No.6285-2 - 2017/09/06 (水) 21:14:57 - AP うまくできない、とは何がどうなった状態なのか。 そんな説明じゃ0点だ。

核抽出（ダウンスホモジナイザー） 削除/引用 No.6285-1 - 2017/09/06 (水) 18:04:08 - あべし 　実験初心者のものです。 　研究室でChip assayを行うことになったのですが、 　核抽出の工程が上手にできません。 　原因としてはホモジナイザーの使い方やLysis Bufferの量の 　 　関係かな、と思っています。 　培養細胞をもちいて核抽出を行う場合、細胞に対してLysis Bufferの 　量はどれくらいで行うのでしょうか？

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