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(無題) 削除/引用 No.6295-11 - 2017/09/11 (月) 01:07:11 - うーん APさん なるほどそういうことなのですね。 しかし私はAmp耐性ベクターを増やす際も植え継ぎ普通にして全く問題になったことがなかったので知りませんでした。 一応、ちゃんとした理由はあるのですね。 しかしCS-RfAさんの今回の問題を解決するに十分なテクニックかどうかはやってみないことにはわかりませんね。

(無題) 削除/引用 No.6295-10 - 2017/09/10 (日) 23:07:31 - AP タブーは言い過ぎかもしれないけど、 アンピシリン耐性をもたらすラクラマーぜは分泌性でして、培養液を植え継いだ時、相当なキャリーオーバーがあります。そのため、早いうちにアンピシリン濃度が下がって、非耐性菌が増えやすいってことなんですけど。どういう論議であったか、検証したいのなら、発言者の言葉に従って、過去トピを検索してみたら。

(無題) 削除/引用 No.6295-9 - 2017/09/10 (日) 22:43:20 - うーん >Amp耐性のプラスミドを液培から液培へ植え継ぐことは禁忌だというのは、このフォーラムの頻出トピックです。プラスミドが切れないこととは関係ないかもしれませんが。 禁忌！？ 初めて聞きましたよそんなこと。みんな普通にやってると思うけど。。。 質問者にちゃんと答えない回答するくらいなら（よくわからない回答）、そもそも書き込むべきでは無いのでは？ 具体的にどうダメなのか私自身すごく気になるので是非教えてください。 なぜ禁忌なの？？？

(無題) 削除/引用 No.6295-8 - 2017/09/10 (日) 22:26:30 - 小言幸兵衛 Amp耐性のプラスミドを液培から液培へ植え継ぐことは禁忌だというのは、このフォーラムの頻出トピックです。プラスミドが切れないこととは関係ないかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.6295-7 - 2017/09/10 (日) 15:09:16 - おお >おっしゃる通り4度を経ずにやるのも手かもしれませんが、miniでワークしてmidiでワークしない理由の答えになるのかはわかりません。 まず、ライゲーションなどでトランスフォーメーションして得られたシングルコロニーは厳密にHomogenousとは言い切れません。場合によってはコロニーを線画培養して、もう一度シングルコロニーを得たほうがいいという人もいます。得られたプラスミドをTransformationすると同じようなプロセスをやっているのと同様とも言えるでしょう。 miniでワークしてmidiでワークしないという視点よりは（そういう原因も一部ありそうですが、）、たとえばあまり大腸菌と相性が良くないプラスミドは、大腸菌内で変化した場合そちらのほうが増殖に有利などの理由でもともとのほしいプラスミドを持ったものがマイナーな集団になってしまったりします。でストレスをあたえるとそういう変化が起こりやすそうだという感触があります。 CcdBはたしかにCcdAが発現する大腸菌では増えるのですが、CcdBが完璧にブロックされるかというとおそらく微量でもCcdA-CcdBコンプレックスから逃れたものがプラスミドに悪さしたりする可能性があるので、プラスミドが不安定になるかもしれないという推測はできます。 そのようなことを踏まえると、プラスミドのOriによるかもしれませんけど、培養温度を少し下げたり３０度ぐらいとか、抗生物質の濃度を最低限量まで下げたりして増やすといいかもしれません。回収数時間前に温度を上げたり、通常濃度の抗生物質の培地に置換すると収量的にはよりいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6295-6 - 2017/09/10 (日) 13:48:44 - CS-RfA おおさん 今回の目的は、RfAを残したままのものを作る、なのでインサートを入れてもRfAは残ったままになります。ですので別のコンピ、例えばDH5αなどは使えません。 おっしゃる通り4度を経ずにやるのも手かもしれませんが、miniでワークしてmidiでワークしない理由の答えになるのかはわかりません。 一度、おおさんがおっしゃられる点を踏まえてやってみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6295-5 - 2017/09/10 (日) 13:19:55 - MP CS-RfA はおそらく理研のレンチベクターですよね。だとするとRfAは初期のccdBカセットを使っているので、現在売られているccdB survivalではうまく増えません。そのあたりは大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6295-4 - 2017/09/10 (日) 07:31:31 - おお 大腸菌がちょっとでも嫌がる配列をもつプラスミドは、場合によってはそういうことがありえます。CcdBが入っているそうですが、これは目的のものが入れば抜けるのですか？それともどどまるけどプラスミド上で制御がかかるのですか？ ミニプレップで得られた、インサートが入ったものを大腸菌にトランス・フォーメーションしてコロニーからなるべくストレスをかけず（４度保存などさけて）Midiなどラージスケールに持っていくといいかもしれません。その時使う大腸菌の株は相性などを考慮して違うものを使ってもいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6295-3 - 2017/09/10 (日) 02:02:01 - CS-RfA APさん シークエンスを読んで見ます。 アルカリ変性についてですが、invitrogenのキットを使って抽出しました。その際、プロトコルに沿って行ったためアルカリ液を入れてから5min, RTで待ちました。今まで一度もこのステップが問題だと感じたことはないですが、CS-RfAベクターで初めて問題が起きたのでこのベクター特有の何かがあるのだと思っていました。 原因は不明ですがひとまずシークエンス結果を待って、それからまた考えます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6295-2 - 2017/09/09 (土) 22:25:34 - AP スケールアップした時のアルカリ変性の条件が過剰だったとか。部分変性で制限酵素が効かなくなった。温度が高かった、時間が長かったなど。スケールが大きいとアルカリ溶菌がすんなりいかないために長く置きがち。 トランスフォーメーション、トランスフェクションに使うなら、部分変性していても使えないことはない。シークエンスだけはチェックしておいたらいいだろう。 部分変性を避けるなら、菌の沈殿を再懸濁してからlysozemeで処理してから手早くアルカリ溶菌。

CS-RfA plasmidのmidiprep 削除/引用 No.6295-1 - 2017/09/09 (土) 19:05:34 - CS-RfA CS-RfAにインサートを挿入したコンストラクトをmidiprepすると、miniprepで切れていたものが切れなくなっているという問題に直面しており皆様のお知恵、ご助言をいただきたくトピックを作成しました。 具体的にはCS-RfAに４つの制限酵素サイト（以降、インサートと記載）を入れたベクターを作ろうとしています。インサートはRfAの後に入れており、当然のことながらCS-RfAのベクター内に存在しない制限酵素サイトです。 まずオリゴをアニールさせることでインサートを作成し、CS-RfAとライゲーションし、CcdB survival(invitrogen)を使用しトランスフォーメーション後、コロニーをピックアップしました。 その際、LB mediumを2mlでピックアップした菌を37度, 200rpmで増やしました。 翌日、1mlをminiprepに使用し、残りは４度で保存し、miniprep後のDNAを制限酵素（インサートが入ったもののみで切れる）でカットしたところ、uncutではバンドがスメアになるのに対し、インサート内に含まれる制限酵素で切ったものはシングルバンドとして確認することができました。 そこで4度で保存しておいた菌を100ml LB mediumに移してO/N後、midiprepを行い、再度DNAを制限酵素で切ると、miniprepでは切れていたものが切れなくなっていました。 このような経験は今までなく、非常に困っているのですが、問題点等お気付きの方ご助言いただけませんでしょうか？

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