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(無題) 削除/引用 No.6306-10 - 2017/09/19 (火) 12:27:25 - ひーで おお様 293TのGFP蛍光が本当に自己感染によるものかは分からないのですが、少なくとも293T細胞のGFP蛍光強度と標的細胞の感染効率には（標的細胞の種類によらず）非常に良い相関がありますので、問題は標的細胞側ではなく、ウイルス産生細胞側ではないかと推察しています。また同じロットのDNAを用いてもその時々でタイターはばらつくので、コンストラクトの違いによるものでは無いと考えています。DNAの精製はqiagen midi kitを使っており、質としては問題無いと考えています。同様に精製したDNAを用いて、同じ293T細胞を用いたタンパク質の過剰発現実験などは、良好に行なえています。

(無題) 削除/引用 No.6306-9 - 2017/09/19 (火) 12:11:21 - おお 自己感染せずともGFPポジは検出されると理論的には思えますが、それでも自己感染によるものと考えるなにか根拠になりそうな物があるのでしょうか？ あと、ばらつきで考えられる要素はDNA（プラスミド）のクオリティーとかプラスミドのコンストラクション（構成）が悪いとかでしょうか。同じプラスミドを使ったとき、再現よく効率が悪いということはありませんか？自己感染せずともGFPポジは検出されると理論的には思えますが、それでも自己感染によるものと考えるなにか根拠になりそうな物があるのでしょうか？ あと、ばらつきで考えられる要素はDNA（プラスミド）のクオリティーとかプラスミドのコンストラクション（構成）が悪いとかでしょうか。同じプラスミドを使ったとき、再現よく効率が悪いということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.6306-8 - 2017/09/19 (火) 11:34:55 - ひーで X様 ウイルス作製時のその時々の293T細胞へのトランスフェクション効率は分からないのですが、トランスフェクション後７２時間経つと恐らくは産生されたウイルスの自己感染による293T細胞自身のGFP蛍光が見えてくるのですが、その蛍光強度と、そのときのウイルスの実際の標的細胞への感染効率には非常に良い相関があります。これは標的細胞の種類には左右されないので、ウイルスのタイターのばらつきは293T細胞側の問題（トランスフェクション効率の低下やウイルス産生能力の低下）によるのではないかと考えています。ただ購入後間もない継代回数の少ない新鮮な細胞を使っていますので、細胞自身の問題とは考えにくく、またトランスフェクション方法もlipofectamine2000は効率・安定性ともに非常に高い試薬ですので、なぜこのようなばらつきが生じてしまうのか、分からないと言ったところです。

(無題) 削除/引用 No.6306-7 - 2017/09/18 (月) 07:10:05 - X VSVG pseudotypedのレンチウイルスの場合、on iceでもある程度安定かもしれませんが、培地交換ごとにウイルスが希釈されてしまうので、タイターの面ではデメリットかもしれませんね。 私も、４８時間と７２時間で比較した経験があります。トピ主さんと同じく、７２時間の方が少し良いタイターが得られたので、以後７２時間でやってます。推奨プロトコールでは４８時間になっている場合が多いことは存じております。 ばらつきに関しては、293Tへのトランスフェクション効率と、取れたウイルスを感染した標的細胞でのGFP陽性率の間には、だいたい相関がある感じでしょうか？　であれば、293Tへのトランスフェクションのばらつきが問題と考えられます。一方、293Tへのトランスフェクションはコンスタントに入るけれど、標的細胞でのGFP陽性率のばらつきが問題という事なら、標的細胞側の問題の可能性も考える必要があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6306-6 - 2017/09/16 (土) 10:34:50 - おお レンチは失活が早いのですか？ ＞72時間まで24時間おきに、、、 これだと一日目に回収したものは保存中にだめになってませんか？４度なら安定ということですか？

(無題) 削除/引用 No.6306-5 - 2017/09/15 (金) 19:24:26 - ひーで xtremeスキ　様 ご助言ありがとうございます。 確かにレンチは失活が早いので、７２時間というのは長いかも知れません。実際、推奨プロトコールにも４８時間と書かれていました。それで私も最初は４８時間で試していたのですが、いちど時間を振ってみると７２時間のほうが若干タイターが高いウイルスが得られたので、その後は７２時間発現させていました。おそらく駄目な時はそもそも293T細胞からのウイルス産生量が低いのではないかと考えています。ただ教えて下さった方法も、一度どうなるか試してみようかと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6306-4 - 2017/09/15 (金) 17:06:56 - xtremeスキ 72時間の1ポイントだと早い時点のウイルスは失活し始めてうかも。 参考になるかはわかりませんが、私がパッケージングするときの方法を。 ・リポフェクション6hで培地交換 ・72時間まで24時間おきに培地交換(回収)し、回収した上清を冷蔵庫内のスチロール容器に入れた氷水中にプール ・0.22フィルター後小分けして液体窒素で急速凍結、-80度保存 72時間そのまま放置は長すぎるんじゃないかしら？ってことです。

(無題) 削除/引用 No.6306-3 - 2017/09/14 (木) 12:07:18 - ひーで X様 ご助言どうもありがとうございます。 ウイルスのタイターを正確に測定することはしていないのですが、感染細胞がGFP蛍光を発するようになっているため、その蛍光強度・発現細胞の割合を見てタイターを判断しています。 そのような判断方法で見た場合に、同じSINベクターを用いた場合でも、ウイルス作製時によってタイターに非常にばらつきが生じます。おおよそ感染効率で見て５〜９０％くらいの差が出ます。 PEIは私も何度か試したのですが、私のやり方がまずいのかもしれませんがトランスフェクション効率そのものにばらつきが大きく、また幾つか条件を振ってみても、うまくいった場合でも発現効率はlipofectamineの半分程度で、うまくいきませんでした。ただリン酸カルシウム法はこれまで試していませんので、とりあえず試薬を自作してやってみようと思います。 重ねて、どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6306-2 - 2017/09/14 (木) 09:01:34 - X ウイルスが得られているかどうかの判定はどのようになさっていますか？　実際のタイターにして、どれくらいのバラツキでしょうか？　同じSINベクターでも実験によってバラつくのか、ベクターを変えるごとにバラつくのか、それによって考える事が変わってくると思います。 リン酸カルシウム法で、本当に上手く行く環境が整っていれば、リポフェクタミンより高いタイターのウイルスが取れると思います。また、トランスフェクション試薬をPEIにすれば、安価なので、低タイターでも大量に調整して濃縮するという形で、力づくで解決する事も可能かも。

レンチウイルスの作製 削除/引用 No.6306-1 - 2017/09/12 (火) 19:06:20 - ひーで 293T細胞にベクターをトランスフェクションすることでレンチウイルスを作製しているのですが、ウイルスが得られないことがままあり、困っています。 細胞は新しく購入した293T細胞を用いており(clontech lenti-X 293T cell)、フリーズストックをその都度起こして使用しています。ウイルス作製用ベクター（パッケージング、VSV-G,Rev、SINベクター）はQIAGENのmidi kitで精製したものを使用しています。またトランスフェクションにはlipofectamine2000を用いており、トランスフェクション後６時間で培地交換、その後３日間培養し、その培養上清をウイルス液として使用しています。 293T細胞の継代回数が多くなるとウイルス産生能が非常に悪くなることはこれまでの経験で分かっており、新しく購入した細胞を使うようになってからかなりうまくいくようになったのですが、しかしそれでも非常に少量のウイルスしか得られないことが時々あります。なおトランスフェクションは幾つかの試薬を試した中でlipofectamine2000が最も導入効率が良く安定していたためこれを採用しました。 何か解決策の思いつく方はおられますでしょうか。

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