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混合塩基プライマーの塩基存在比率 トピック削除
No.6429-TOPIC - 2017/10/30 (月) 12:57:50 - mss
6,7年前に似た内容のトピックが複数あったのですが、どれも納得のいく回答ではなかったので新たに質問させていただきます。
混合塩基プライマーの(受託)合成に関する質問です。

アミノ酸1残基をランダムに変異するため、
プライマーの1か所を混合塩基NNNにしたものを業者に委託しました。
しかしクローニング・形質転換後に配列を解析したところ
NNNの箇所をTまたはGが非常に多く占めA,Cが少ない分アミノ酸にもバイアスがかかっています。

PCRはNNN部分がTmに影響しないようプライマーを設計し、
プラスミド抽出のための培養中も発現漏れによる増殖の差がないようにしています。

そのため原因は「そもそもプライマー合成時に一定の比率で塩基が入っていない」と考えています。
そこで複数の業者(マク○ジェン、ユー○フィン、ファ○マック)で同じプライマーを
試したのですが、やはり同様の結果でした。

長くなりましたが質問は
・合成塩基の比率を保証してくれる業者はあるのでしょうか
(そのような業者があると7年前のトピックにあったのですが見つけられませんでした)
・または別の原因が考えられましたら教えていただきたいです。
 
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.6429-12 - 2017/11/05 (日) 16:17:28 - mss
みなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.6429-11 - 2017/10/30 (月) 20:56:21 - moz
Cysを含めると VNS,TNCかな。コドンテーブルと睨めっこしただけです。
あっ、TMC, TNCともTGG(Trp)が含まれていないですね。
そのため3本になりますね。

(無題) 削除/引用
No.6429-9 - 2017/10/30 (月) 18:28:28 - mss
独り言様

実は以前そちらのサービスを利用したのですが
値段が高い上に指定した変異が網羅できていなかった
(こちらでクローニングした結果ではなく、業者の納品前データ)ので今後は利用しないつもりです。
ちゃんと合成してくれるところは、やはりそれなりの値段がするのでしょうね...


moz様

Cysも含めたいと思っているので今回はNNKで進めたいと思います。
ただVNS,TMCなるものは初めて知りました。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6429-8 - 2017/10/30 (月) 17:12:37 - moz
Cysを使わないなら、VNS or TMCの2本作るのも冗長性が少なくて良いよ。

(無題) 削除/引用
No.6429-7 - 2017/10/30 (月) 16:21:31 - 独り言
通常のランダムのプライマー合成ではないですが、
遺伝子合成を利用すれば、おそらく保障してもらえるのではないかと思います。
例えば、Thermoなら特定の塩基配列の中だけでランダムにオリゴを作ってくれるGene
artのサービスがあるはずです。なのである程度ランダムであることは保障されているのかなと思います。(試したことないので、正確なことはわかりません)

https://www.thermofisher.com/jp/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/directed-evolution/geneart-controlled-randomization-.html

完全にランダムというよりむしろ特定の塩基やアミノ酸の中でランダムとかの条件によいですが。

変異の数にもよりますが、値段は普通のオリゴのように安くはなさそうです。

(無題) 削除/引用
No.6429-6 - 2017/10/30 (月) 15:11:30 - mss
中年様

PCR回収時はプラトーに達していないようにしています。
ただ、達していた場合には修復系に影響されるという可能性もあるのですね。
今後注意したいと思います。

またNNK,Sについては一般的ではないかと思いNNNと表記しました。
ラボではNNKを使っています。
ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.6429-5 - 2017/10/30 (月) 13:37:42 - 中年
×アミノ酸のしたいのなら
◯アミノ酸にしたいのなら

×方より
◯偏り

でした。

(無題) 削除/引用
No.6429-4 - 2017/10/30 (月) 13:23:52 - mss
あかね様

ありがとうございます!
マニュアルで変えられるところがあるのですね
早速聞いてみます。

(無題) 削除/引用
No.6429-3 - 2017/10/30 (月) 13:21:53 - 中年
お使いのPCRの条件は、終盤のサイクルでもまだ指数的に増幅しているようなものでしょうか、それとも最後の方はプラトーに達しているでしょうか。

後者であれば、産物のNNNに相当する部分はヘテロデュープレックスになっているはずなので、大腸菌の中でどちらが修復されてどういう産物が得られるかは大腸菌の修復系の特性に依存するでしょうから、その結果として均一な分布になっていない可能性があるように思います。

お尋ねのポイントからは外れますが、単純にランダムなアミノ酸のしたいのなら、NNNよりもNNKやNNSの方がstopコドンの割合が減り、アミノ酸ごとのコドン数の方よりも小さくなります。

(無題) 削除/引用
No.6429-2 - 2017/10/30 (月) 13:08:26 - あかね
IDTに問い合わせてみては。

これまでの経験から混合比をマニュアルで変えてくれます。
まずは、IDT JAPANに相談してみることをオススメします。丁寧に答えてくれます。

混合塩基プライマーの塩基存在比率 削除/引用
No.6429-1 - 2017/10/30 (月) 12:57:50 - mss
6,7年前に似た内容のトピックが複数あったのですが、どれも納得のいく回答ではなかったので新たに質問させていただきます。
混合塩基プライマーの(受託)合成に関する質問です。

アミノ酸1残基をランダムに変異するため、
プライマーの1か所を混合塩基NNNにしたものを業者に委託しました。
しかしクローニング・形質転換後に配列を解析したところ
NNNの箇所をTまたはGが非常に多く占めA,Cが少ない分アミノ酸にもバイアスがかかっています。

PCRはNNN部分がTmに影響しないようプライマーを設計し、
プラスミド抽出のための培養中も発現漏れによる増殖の差がないようにしています。

そのため原因は「そもそもプライマー合成時に一定の比率で塩基が入っていない」と考えています。
そこで複数の業者(マク○ジェン、ユー○フィン、ファ○マック)で同じプライマーを
試したのですが、やはり同様の結果でした。

長くなりましたが質問は
・合成塩基の比率を保証してくれる業者はあるのでしょうか
(そのような業者があると7年前のトピックにあったのですが見つけられませんでした)
・または別の原因が考えられましたら教えていただきたいです。

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