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マウス組織からのマクロファージ単離方法 トピック削除
No.6435-TOPIC - 2017/11/02 (木) 11:48:29 - まくろ
現在マクロファージをマウス組織 (Liver (Kupffer cell), Small intestine, Kidney) から単離しようとしている者です。
単離とは書きましたが、実際フローサイトメトリーで解析できれば良いので、マクロファージがある程度取れていれば問題ありません。
これまで、Collagenase IVで細かく切った臓器を処理(1 h, 37℃, 140 rpm shake)し、cell strainerで濾し、溶血(腎臓、肝臓)を行うといった形をとっております。(小腸はこの作業の前にEDTAで上皮細胞を除去)
腎臓、肝臓については、33% Percollに懸濁し、800 g 30 min 25℃で遠心分離し、ペレットになった細胞を回収し、解析。
小腸については、44% Percollに懸濁し、下に67% Percollを重層、600 g 20 min 25℃で遠心分離し、44%/67% Percoll 境界に浮遊している細胞を回収し、解析しております。

フローサイトメトリーで解析したところ、Kupffer cell (CD11b+ F4/80+ SSC,FFCもマクロファージらしい) は割合が少ないものの確認できたのですが、小腸や腎臓についてマクロファージと思われる集団は確認できませんでした。
CD11b+ F4/80+の集団が好酸球しか取れてきませんでした。

取り方に問題があると思われるのですが、アドバイスいただけないでしょうか。
よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.6435-3 - 2017/11/08 (水) 09:16:25 - X
小腸の細胞分離でお使いのPercoll67%だと、比重はどれくらいになりますか？　マクロファージをトラップするにはちょっと低いかもしれません。念のため下に落ちた細胞も調べてみると良いかもしれません。

検出されたCD11b+F4/80+細胞を好酸球と判断した理由は何でしょう？　FSC/SSCだけなのか、あるいはSiglec-Fとかも染めた上での結論でしょうか？　Siglec-Fの場合、マクロファージでも組織によっては染まる可能性もあり、決定的ではないですが、参考にはなると思います。あと、F4/80のFACSはトリッキーな面もあり、ポジコンになる細胞を準備できるとベターと思います。

小腸粘膜下層のCD11b+細胞は、主にCD103+樹状細胞とマクロファージだと思うのですが、好酸球のコンタミが問題になるか、ちょっと分かりません。お使いのPercollの濃度だと、好酸球は大多数がペレットに落ちてしまうと思われ、中間層にトラップされる可能性は低いです。よって、検出されたCD11b+ F4/80+細胞がマクロファージという可能性もあるような気がします。　

小腸粘膜下層の単核球分離の場合、EDTAで腸上皮を除去した後、酵素処理にかけるのが定番ですが、collagenaseだけでなく、DNaseは最低限加えた方が良いと思います。これらの酵素はCa2+存在下で最大活性を示しますが、カルシウムの入っている培地内で酵素処理してますよね？　

個人的な経験では、溶血処理を密度勾配の前にやってしまうと、分離が上手くいかなかったので、溶血処理は密度勾配の後にしてます。私が下手なだけかもしれませんが、ご参考まで。

(無題) 削除/引用
No.6435-2 - 2017/11/03 (金) 12:45:36 - あなろぐ
脾臓、胸腺なら
PBSいれたシャーレの上でスライドガラスのザラザラしたとこですりつぶす
15mLチューブに移して溶血
セルストレイナーなどなにかしらフィルターに通す
で生きたCD11b+細胞やT細胞をソーティングできたことはあります。
腎臓、肝臓、腸はやったことないのでご参考まで。

マウス組織からのマクロファージ単離方法 削除/引用
No.6435-1 - 2017/11/02 (木) 11:48:29 - まくろ
現在マクロファージをマウス組織 (Liver (Kupffer cell), Small intestine, Kidney) から単離しようとしている者です。
単離とは書きましたが、実際フローサイトメトリーで解析できれば良いので、マクロファージがある程度取れていれば問題ありません。
これまで、Collagenase IVで細かく切った臓器を処理(1 h, 37℃, 140 rpm shake)し、cell strainerで濾し、溶血(腎臓、肝臓)を行うといった形をとっております。(小腸はこの作業の前にEDTAで上皮細胞を除去)
腎臓、肝臓については、33% Percollに懸濁し、800 g 30 min 25℃で遠心分離し、ペレットになった細胞を回収し、解析。
小腸については、44% Percollに懸濁し、下に67% Percollを重層、600 g 20 min 25℃で遠心分離し、44%/67% Percoll 境界に浮遊している細胞を回収し、解析しております。

フローサイトメトリーで解析したところ、Kupffer cell (CD11b+ F4/80+ SSC,FFCもマクロファージらしい) は割合が少ないものの確認できたのですが、小腸や腎臓についてマクロファージと思われる集団は確認できませんでした。
CD11b+ F4/80+の集団が好酸球しか取れてきませんでした。

取り方に問題があると思われるのですが、アドバイスいただけないでしょうか。
よろしくお願いします。
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