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(無題) 削除/引用 No.6567-17 - 2018/01/13 (土) 20:21:04 - takuya あqszdxcfgvbhjkんlm；。　様 ＞TLRsみたいなパタン認識受容体から発するシグナル伝達経路のゴールにはNFkBがある事が多いので、TLRsのリガンドとかは検討されてはどうですか。たとえばLPSとかいいのでは。IkBのリン酸化に至るまでの経路をみてみるとわかるとおり複雑で、そのどこかに関わってるとはおもうけど、ここから先の絞り込みがとても難しいのです。あまり労力かけずにサクッと見るだけでいいならば、NFkB関係の抗体のsamplar antibody kitとかでやってみればなにかみつかるかもしれない。ガチでやるならphosphoproteomicsがあります。 あとリン酸化以外の他の修飾も考えたほうがいいです。 教えていただき、本当にありがとうございます。 human由来の同組織の細胞(軟骨細胞)に、その因子のsiRNAをしてみました。 すると、LPSやIL-1βやTNFαでも末梢の炎症系蛋白や基質分解酵素のmRNA発現が低下しており、共通する下流に作用している可能性を考えて、ウエスタンでNFκBの因子をみてみたところ、IκBαのリン酸化の抑制、total p65の核内移行も抑制されていました。KOでは顕著にみられました。 状況的には、IκBα、もしくはその少し上流のところなのかなと考えております。 ご指摘いただきありがとうございます。リン酸化以外の可能性も検討してみます。。

(無題) 削除/引用 No.6567-16 - 2018/01/13 (土) 20:13:28 - takuya MP様 ＞だとすると、この分子はIKKの上流にあると考えるのがリーズナブルでは？もちろんIKKと並行的にIkBをリン酸化している可能性もあるけど、もしそうなら割と大発見かも。 ご指摘有難うございます。ご指摘いただいた通り、IKKの上流に作用している可能性も、考えないといけないかと思います。 シグナルのどこに関連しているのかをみることに大変やりがいは感じるものの、自分の無知に愕然とするばかりです。。 がんばって検証していきたいです。 貴重なご意見、本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6567-15 - 2018/01/13 (土) 18:04:16 - あqszdxcfgvbhjkんlm；。／ TLRsみたいなパタン認識受容体から発するシグナル伝達経路のゴールにはNFkBがある事が多いので、TLRsのリガンドとかは検討されてはどうですか。たとえばLPSとかいいのでは。 IkBのリン酸化に至るまでの経路をみてみるとわかるとおり複雑で、そのどこかに関わってるとはおもうけど、ここから先の絞り込みがとても難しいのです。 あまり労力かけずにサクッと見るだけでいいならば、NFkB関係の抗体のsamplar antibody kitとかでやってみればなにかみつかるかもしれない。ガチでやるならphosphoproteomicsがあります。 あとリン酸化以外の他の修飾も考えたほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.6567-14 - 2018/01/11 (木) 23:02:37 - MP > リン酸化をウエスタンで見る際、IL-1βで刺激してから評価いたしました。WTでは刺激後5-10分後〜45分後くらいまでp-IκBαが見えましたが、KOではWTと比較して明らかにバンドが薄い所見でした。 だとすると、この分子はIKKの上流にあると考えるのがリーズナブルでは？もちろんIKKと並行的にIkBをリン酸化している可能性もあるけど、もしそうなら割と大発見かも。

(無題) 削除/引用 No.6567-13 - 2018/01/11 (木) 21:47:11 - takuya KIO様 ＞これはrescue実験とは言えないでしょう。rescue実験とは”おお”さんが指摘されているようにK/Oした遺伝子に由来するタンパクを補うことで表現型が野生型に回復することを示す実験のはずですよ。 ご指摘本当に有難うございます。rescue実験の定義をきちんと理解していませんでした。。 KOマウスからとってきた細胞に、(overexpressionの要領で)KOされているその因子を強制的に発現させて、末梢の現象(mRNA発現 and 蛋白レベル)が回復するかどうかをみてみたいと思います。 大変勉強になります。 私が不勉強なところ、親切に教えていただいて本当にありがとうございます。。

(無題) 削除/引用 No.6567-12 - 2018/01/11 (木) 15:10:11 - takuya おお様 ＞(おお様)トランスフェクションのマニピュレーションができそうなら、KOにその遺伝子発現ベクターをトランスフェクションして、活性回復があるのか、あった場合IKKなどのインヒビターでブロックできるのかをみることができると思いました。コンスティチューティブアクティブなTAK1やIKKなどがあればそれでもいいかもです。 本当にありがとうございます。 rescue実験の定義を私がきちんとわかっておりませんでした。申し訳ありません。。 KO細胞に、その遺伝子を導入し、下流の現象が回復するのか(mRNA or 蛋白レベル)、それがrescue実験といえるのですね。本当に有難うございます。 さらに、上流のIKKｲﾝﾋﾋﾞﾀｰをそこにかけてみて末梢の蛋白がmRNAor蛋白レベルでinhibitされるのか、もしそこでinhibitされないようであれば、その因子がIKKに作用しているわけではなく、IκBαに作用しているといえるわけですね(in vitro kinase assayでIκBαを基質とすることが言えていないといけないと思いますが)。

(無題) 削除/引用 No.6567-11 - 2018/01/11 (木) 14:28:34 - takuya MP様 ＞背景が今ひとつわからない、KOでIκBαのリン酸化が抑制されているとのことですが、WT細胞では恒常的にIκBαのリン酸化が見えるということでしょうか？それとも何か刺激を入れての話？ ご指摘誠に有難うございます。言葉足らずで申し訳ありません。 リン酸化をウエスタンで見る際、IL-1βで刺激してから評価いたしました。WTでは刺激後5-10分後〜45分後くらいまでp-IκBαが見えましたが、KOではWTと比較して明らかにバンドが薄い所見でした。

修正 削除/引用 No.6567-10 - 2018/01/11 (木) 12:38:08 - KIO In vivoの実験→細胞の実験 でした・・・ ＞in vitro kinase assayを一から試薬をそろえるとなればかなりお金はかかるものですよね？ かかります。特にアイソトープを使用したclassicなリン酸化実験（レビューで求められたのはこれ）は費用だけでなく手間も非常に掛かります。 ＞rescue実験として、ノックアウトマウス由来細胞にNFκBのactivatorをふりかけて、NFκBの抑制(KOによる)作用が相殺されるのか これはrescue実験とは言えないでしょう。rescue実験とは”おお”さんが指摘されているようにK/Oした遺伝子に由来するタンパクを補うことで表現型が野生型に回復することを示す実験のはずですよ。

(無題) 削除/引用 No.6567-9 - 2018/01/11 (木) 10:22:12 - MP 背景が今ひとつわからない、KOでIκBαのリン酸化が抑制されているとのことですが、WT細胞では恒常的にIκBαのリン酸化が見えるということでしょうか？それとも何か刺激を入れての話？

(無題) 削除/引用 No.6567-8 - 2018/01/11 (木) 09:55:03 - おお >KOでNFκBが抑制されており、rescue実験でNFκBをactivateさせる物質を探しております。 トランスフェクションのマニピュレーションができそうなら、KOにその遺伝子発現ベクターをトランスフェクションして、活性回復があるのか、あった場合IKKなどのインヒビターでブロックできるのかをみることができると思いました。 コンスティチューティブアクティブなTAK1やIKKなどがあればそれでもいいかもです。

(無題) 削除/引用 No.6567-7 - 2018/01/11 (木) 04:47:50 - takuya おお様 ＞IκBのリン酸化を直接的にしていると知られる酵素は IKK complex (IKKβ, IKKα, and NEMO)でこのインヒビターなどは使えませんか？ またIKK complexが活性化しているかどうかをKOと正常で比べるのもSuggestiveなデーターになると思いますが。 ご教示本当にありがとうございます。私の記載がわかりにくくて申し訳ありません。 KOでNFκBが抑制されており、rescue実験でNFκBをactivateさせる物質を探しております。教えていただいたIKKのactivatorを使用すればよいかと思います。IKKのactivatorとしては、やはりLPSやIL-1β、TNFα等、上流の物質となってしまいますよね。。 IKK complexの活性化度合いの比較に関して、教えていただいて有難うございます。なるほど、確かにこれをすれば、結果によっては、IKKに作用せずにIκBαに作用していることを言えますよね。ぜひこれもやってみます。 有益な情報を本当に有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.6567-6 - 2018/01/11 (木) 04:18:56 - おお IκBのリン酸化を直接的にしていると知られる酵素は IKK complex (IKKβ, IKKα, and NEMO)でこのインヒビターなどは使えませんか？ またIKK complexが活性化しているかどうかをKOと正常で比べるのもSuggestiveなデーターになると思いますが。 ttps://www.tocris.com/pharmacology/i-kappab-kinase

(無題) 削除/引用 No.6567-5 - 2018/01/11 (木) 02:26:16 - takuya mon様 ＞細胞を刺激するならTNFが多用されると思うけど、目的に合うかな？（深く考えていないのであしからず） ご教示、誠に有難うございます。 できれば、より下流のNFκBに直接かかわるactivatorを探しています。。わかりにくい記載で申し訳ありません。。 参考にさせていただきます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6567-4 - 2018/01/11 (木) 02:21:54 - takuya KIO様 ＞protein Aがprotein Bをリン酸化する ということを証明するにはrecombinant proteinを使用したin vitro実験が必要ではないでしょうか？ In vivoでの実験からは、ある因子がIkBをリン酸化するIKKなどを活性化する可能性もあるのではないでしょうか？ 教えていただき、本当にありがとうございます。 本当にIκBαを基質としているか、interactしているかをみるためにin vitro kinase assayを行うということですね。 普通のウエスタンの結果(KOでのIκBαのリン酸化の抑制やp65の核内移行の抑制)だけでは、IKKに作用している可能性もあるということですよね。 なるほど、確かにその通りですよね。。ありがとうございます。。 他のラボに協力をお願いできるか、あたってみます。 ちなみに、in vitro kinase assayを一から試薬をそろえるとなればかなりお金はかかるものですよね？。。 ＞なお、NF-kB activatorとしてはphorbol esterなどがあります、念のため。 ありがとうございます。rescue実験も行いたいので、非常に参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.6567-3 - 2018/01/10 (水) 17:45:31 - mon 細胞を刺激するならTNFが多用されると思うけど、目的に合うかな？（深く考えていないのであしからず） ttp://www.abcam.co.jp/research-areas/overview-of-nf-b-signaling ttps://www.cellsignal.com/contents/science-cst-pathways-immunology-and-inflammation/nf-b-signaling-interactive-pathway/pathways-nfkb

in vitro 削除/引用 No.6567-2 - 2018/01/10 (水) 14:46:59 - KIO protein Aがprotein Bをリン酸化する ということを証明するにはrecombinant proteinを使用したin vitro実験が必要ではないでしょうか？ かつて、自分もレビューで要求されましたよ。 In vivoでの実験からは、ある因子がIkBをリン酸化するIKKなどを活性化する可能性もあるのではないでしょうか？ なお、ラボにこういうリン酸化実験のしたことがない場合、in vitro実験系を組み立てるのは困難ですので、他のラボなどから経験者の協力を得ると良いでしょう。 なお、NF-kB activatorとしてはphorbol esterなどがあります、念のため。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18436431

NFκBのactivatorに関して教えてください 削除/引用 No.6567-1 - 2018/01/10 (水) 11:01:12 - takuya 研究開始歴2年弱のまだ初心者で、基本的なことかもしれませんが、教えていただけるとありがたいです。 ある因子のノックアウトマウス由来細胞において、IκBαのリン酸化が著明に抑制され、total p65の核内移行も抑制されていました(Western blotting)。末梢の炎症系蛋白や基質分解酵素のmRNA発現も著明に抑制されていました。 上記より、この因子はIκBαをリン酸化することにより、結果としてNFκBを活性化させる方向に働くと考えております。 本当にIkBαのリン酸化をすることによりNFκBを活性化させるのかを検証するために、rescue実験として、ノックアウトマウス由来細胞にNFκBのactivatorをふりかけて、NFκBの抑制(KOによる)作用が相殺されるのか、末梢蛋白のmRNA発現をreal time PCRで検証しようと考えています。 そこで、NFκBのactivatorをいろいろと調べているのですが、なかなかこれといった実験で使用できそうな物質がありません。 できればIkBαのinhibitor(つまりIκBαをリン酸化させる物質)があれば、実験で使用したいと考えておりますが、ご存知の方はおられないでしょうか。 不勉強で申し訳ありません、ご教示いただけると幸いです。 何卒宜しくお願いいたします。

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