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大腸菌組み替えタンパク質とIPTG トピック削除
No.6569-TOPIC - 2018/01/10 (水) 14:54:53 - mori
実験初心者です。皆様のご意見を伺えればと思います。

大腸菌組み替えタンパク質を培養し、IPTGを加えているときと、加えていない時でどの程度、収量の差があるかを確認しています。
本来ならIPTGを加えてない方が生育に負荷がかからず、IPTGを加えたら生育に負荷がかかり封入体とかになりやすいのでしょうか?

今回実験をした際に、IPTGを加えていない時の方が収量が低く、IPTGを加えている方が収量が高かったので、プラスミドが挿入されていないのではないかと考えました。
 
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(無題) 削除/引用
No.6569-33 - 2018/02/05 (月) 17:05:35 - mon
> 栄養価の存在によって、細胞倍加時間が変化する感じですかね。
Max 20~30分です(37℃)。菌株(変異)によって遅いものがあります。
XL1Blue株だとMax40分かな〜?
同じ菌株なら、LB培地でも、よりrichなTB培地でも細胞倍加時間は変わらない(と思う)けど、定常期の最終OD600が違います。つまりLB培地でも細胞倍加時間がMaxになる分の栄養は(ある程度の細胞密度までは)十分であると言えるでしょう。

> これって早く分裂を早めた場合、定常期に入るのも早くなりますよね?
同じ培地なら温度が低いと定常期に入るまで長く掛かりますが、定常期の最終OD600は変わらないような?
定常期の最終OD600は、培地の栄養価およびエアレーションによって変わります。
例えば、LB < TB, 2xYT です。
経験的にMgを添加あるいはpH低下を抑制すると最終OD600が高くなります。

以上のことは簡単に実験できるので、ご自分で試してください。

(無題) 削除/引用
No.6569-32 - 2018/02/05 (月) 11:58:21 - mori
monさん

色々ありがとうございます。
栄養価の存在によって、細胞倍加時間が変化する感じですかね。
これって早く分裂を早めた場合、定常期に入るのも早くなりますよね?

(無題) 削除/引用
No.6569-31 - 2018/02/01 (木) 17:33:10 - mon
大腸菌は、栄養が豊富にある場合は増殖速度は(その温度での)Maxとなるでしょう。
栄養が足りない場合は、タンパク合成も低下(~停止)し分裂もやめる、となったような。

(無題) 削除/引用
No.6569-30 - 2018/01/31 (水) 18:29:51 - mori
monさん

ご説明ありがとうございます。
分裂が優勢になると、対数増殖期において、分裂速度が早まる傾向になりやすいということになりますか?

文献は図書館で調べてみます。

(無題) 削除/引用
No.6569-29 - 2018/01/31 (水) 18:16:53 - mon
> 培地をより栄養豊富なものを使う等で発現量が増えるというのは、1細胞辺りの発現量の増加が見込めるということでしょうか?
見込めますが、大腸菌は菌体数を増やす(分裂する)方が優勢と思います。

> 大腸菌の代謝を学ぶ上で呼んでおいた方が良い文献とかありますでしょうか?
申し訳ない。知らない。。元々遺伝学のモデル生物だからな〜。
農学部(応用生物学)辺りの方が詳しいのでは。図書館に教科書があると思うよ(古いかも)。

(無題) 削除/引用
No.6569-28 - 2018/01/31 (水) 17:15:06 - mori
monさん

色々ご説明ありがとうございます。

培地をより栄養豊富なものを使う等で発現量が増えるというのは、1細胞辺りの発現量の増加が見込めるということでしょうか?

また、差し支えなければ、大腸菌の代謝を学ぶ上で呼んでおいた方が良い文献とかありますでしょうか?
色々すいません。

(無題) 削除/引用
No.6569-27 - 2018/01/31 (水) 17:10:42 - mori
小言幸兵衛さん

少し疑問に思ったので、大腸菌代謝にも目を向けてみようと思いました。

(無題) 削除/引用
No.6569-26 - 2018/01/31 (水) 16:31:41 - mon
大腸菌に細胞内の異種タンパクを異物と認識できる機能はないようです。
動物細胞にもありません。MHCに提示して免疫細胞が認識して細胞ごと排除するだけです。
ですが大腸菌でも異種DNAは認識できます(制限系)。異種RNAはどうかな〜??

(無題) 削除/引用
No.6569-25 - 2018/01/31 (水) 16:25:00 - mon
> 量とは、ラージスケールか小スケールでの量の変化でしょうか?
一細胞あたりの発現量です。
通常状態でも多少の余裕はあるでしょうが、細胞アミノ酸濃度が減少すると、アミノ酸取り込み量を増やす、さらには翻訳や転写を止めれないようなら細胞内のタンパクを分解してそれに充足する反応がある程度まで亢進するでしょう。
培地をより栄養豊富なものを使う等で発現量が増えることもあります(LB->2xTY等)。
動物由来タンパクの場合、folding出来ずに不溶化することが問題となることが多いです。

(無題) 削除/引用
No.6569-24 - 2018/01/31 (水) 16:03:37 - 小言幸兵衛
大腸菌もアミノ酸が枯渇するまで漫然と翻訳を続けるようなことはないでしょうから、その前に翻訳を抑制する機構があるでしょうね。詳しくは知りませんが。

でも、それ、あなたの実験の方針に関係ありますか?

(無題) 削除/引用
No.6569-23 - 2018/01/31 (水) 15:43:19 - mori
小言幸兵衞さん

大腸菌の代謝に影響となると、翻訳の際にアミノ酸が枯渇になることとかが考えられるのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.6569-22 - 2018/01/31 (水) 15:33:10 - 小言幸兵衛
代謝に影響が有るか無いかと聞かれればもちろん有ります。それがやろうとしている実験で問題になるかどうかはケースバイケースでやってみるしかわかりません。多少生育に問題が生じたとしても十分量のタンパク質が発現する場合も普通にあります。

それ以上、何がお知りになりたいのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.6569-21 - 2018/01/31 (水) 15:19:32 - mori
monさん

量とは、ラージスケールか小スケールでの量の変化でしょうか?

目的の異種タンパク質を得るのは目的ですが、大腸菌の代謝に影響があるのかと疑問に思いました。 大腸菌にとって、異種タンパク質というのは異物みたいな存在だと認識していました。

(無題) 削除/引用
No.6569-20 - 2018/01/31 (水) 14:01:21 - mon
量によります。
「大腸菌代謝に大きく影響する」ことが問題になりますか?
「異種タンパクを得る」ことが目的ではないのですか?

(無題) 削除/引用
No.6569-19 - 2018/01/30 (火) 22:31:46 - mori
monさん

この場合、大腸菌を用いた異種タンパク質発現系によって大腸菌代謝に大きく影響することになりますか?

(無題) 削除/引用
No.6569-18 - 2018/01/29 (月) 19:31:39 - mon
>大腸菌自身の栄養素が奪われていることでしょうか?
アミノ酸は、栄養素でしょ。tRNAはリサイクルできるので厳密には栄養素とはいわないけど、アミノアシルtRNAを作るときにATPを消費しますし。

(無題) 削除/引用
No.6569-17 - 2018/01/29 (月) 15:29:19 - mori
monさん

ありがとうございます。
T7 promoterからの転写量は多いので、それを翻訳するためのtRNAやアミノ酸が枯渇する可能性(生育に負荷がかかる)場合、大腸菌自身の栄養素が奪われていることでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.6569-16 - 2018/01/26 (金) 17:44:34 - mon
>[Re:15] moriさんは書きました :
> IPTGで発現誘導をかけた際に、生菌数の伸びが悪くなる
これは良くある現象だけど、
元の質問の
>IPTGを加えたら生育に負荷がかかり(原因)封入体とかになりやすい(結果)のでしょうか?
おそらくそうではないです。
タンパクの正常なfoldingが出来ないモノを封入体にしておく(ゴミ溜めに集めておく)ことにより、負荷がかからいようにする生体反応です(と考えられている)。もっともデッカイ封入体が出来ると細胞内輸送?(分散?)が阻害される可能性はあるかも。
T7 promoterからの転写量は多いので、それを翻訳するためのtRNAやアミノ酸が枯渇する可能性(生育に負荷がかかる)はあります。この場合不完全長産物が出来やすくなるので分解が追いつかなければ封入体が生成されるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.6569-15 - 2018/01/25 (木) 22:11:42 - mori
IPTG存在下で発現誘導が起こる T7 RNA ポリメラーゼが標的遺伝子の転写を行いタンパク質の合成が開始されると思いました。

IPTGで発現誘導をかけた際に、大腸菌の生育の負担になったり害になると思い、発現誘導をかけていない時より、生菌数の伸びが悪くなると思っていました。

(無題) 削除/引用
No.6569-14 - 2018/01/11 (木) 10:59:29 - おお
>IPTGは発現誘導をかける為におこなっていると考えています。

ではその誘導のメカニズムはなんでしょうか?プラスミドが出てきたりなくなったりするような仕組みが関与してういますか?

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