BioTechnicalフォーラム [制限酵素XbaⅠで切断できない。原因は？]

制限酵素XbaⅠで切断できない。原因は？

No.6679-TOPIC - 2018/02/13 (火) 13:55:39 - 中部の大学生

制限酵素XbaⅠを使用し、疑問点についてお聞きします。
pBluesucriptを使用し、クローニングを行いました。pBluescript側のXbaⅠと導入したcDNA側のXbaⅠの２ヶ所カットを行ったところ、アガロースゲル電気泳動結果では１ヶ所カットの結果でした。
メチル化の原因ではないかと予想しているのですが、その他に考えられる原因がありますでしょうか。

以下に条件を記載します。
・塩基配列
5’ – gatgggggtgctggagatctagaagacccatggtagaagc – 3’
　　　　　　　　　　 (Xba1)
・DH5α株でトランスフェクションを行った。

・導入したcDNAはヒト胎児腎由来HEK293から合成したもの
　

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No.6679-11 - 2018/02/14 (水) 10:24:42 - AP

どうしても切りたかったら、Dam-の宿主を使えばよろしい。
たとえばJM110はDam- Dcm-

(無題)

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No.6679-9 - 2018/02/14 (水) 09:17:22 - mon

ちなみにPCR産物はメチル化配列があってもメチル化酵素がないのでメチル化されていませんので、制限酵素で切断出来ます、

(無題)

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No.6679-8 - 2018/02/13 (火) 19:17:04 - AP

おもいっきり、教科書通りのメチル化による阻害ですね。
gaTCTAGAagaの所だと思いますけど
XbaIとO/Lするメチル化配列はdamのGAtcでしょ。あるじゃん（相補鎖を考えて！）。

あと大腸菌にプラスミドを入れることは歴史的にトランスフェクションとは言いません。

(無題)

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No.6679-7 - 2018/02/13 (火) 16:12:03 - 小言幸兵衛

いや、最初にmonさんが正解を出してるじゃん。

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No.6679-6 - 2018/02/13 (火) 15:23:53 - 中部の大学生

塩基変異はシークエンス解析を行ったところ、2回ほど行い、Xba1サイトが確認されましたので変異なしと言う結論に至りました。

(無題)

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No.6679-5 - 2018/02/13 (火) 15:21:32 - 中部の大学生

導入したcDNAはPCR法を使い、両端に制限酵素サイトを付加し増幅したものです。

付加させた制限酵素でｃDNAとpBluescriptをカットし、Ligation high(TOYOBO)でライゲーションを行いました。

ちなみに導入したｃDNA内のXba1は3'末端近くに存在し、pBluescriptのXba1との距離は1.1kbほどあります。

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No.6679-4 - 2018/02/13 (火) 14:22:17 - mon

ごくごく希に、制限酵素処理（or ligation?）中にnuclease等で1塩基欠失が生じて、制限酵素認識部位が潰れる（なくなる）こともあります。

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No.6679-3 - 2018/02/13 (火) 14:21:30 - み

cDNAはどのようにしてベクターに繋いだの？
インサートが入っていることは確認済のクローンですか？

(無題)

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No.6679-2 - 2018/02/13 (火) 14:14:20 - mon

damメチル化ですね。
www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/jisshirei/archives/2008/05/post_35.html