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(無題) 削除/引用 No.6745-15 - 2018/03/15 (木) 20:10:11 - ななし CSTでは1×SDSサンプルバッファーで培養細胞を懸濁し 即座にソニケーションと100℃ボイルする方法を標準プロトコールとしているようです。 ホームページで公開されています。 試してみてみたところ、リパのインヒビター入りに比べて、リン酸化の検出が劇的に改善しましたので、最近はもっぱらこれです。

(無題) 削除/引用 No.6745-14 - 2018/03/10 (土) 17:29:53 - えあqzsxでcfrvgtbh phospho-protein abを購入するならばなるべくmonoclonal abを使用するようにしています。 部位特異的phspho-protein polyclonal抗体で一番のピットホールはnon-phosphorylated formを認識する抗体が混在する可能性があるからで（これはかなりロット差あり）、結果の解釈を難しくします。このような特異性の問題は単純にバンド位置やポジコンからだけでは判別できませんし、やっかいです。

(無題) 削除/引用 No.6745-13 - 2018/03/10 (土) 12:19:58 - ななしい もう何年か前になりますが、CSTのp-syk抗体（525/526）を使っていて、特定のロットしか当たらないということはありました。 一方、323とか352はロット差が無かったです。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.6745-12 - 2018/03/09 (金) 20:48:42 - おお anti-IkBa IP/anti-pIkBa WBという手もあるかな

(無題) 削除/引用 No.6745-11 - 2018/03/09 (金) 20:26:13 - 7744 抗体の希釈にcan get signal使って見ていました。 マウスのマクロファージ、線維芽細胞、リンパ球では見ることができました。 リン酸化が起こっているのかを間接的に確認するため、一度、anti-pIkBaでなく、anti-IkBaで確認してみてはどうですか？ リン酸化が起こっているなら刺激後に時間経過とともにIkBaの分解が見ることができると思います。

(無題) 削除/引用 No.6745-10 - 2018/03/07 (水) 20:03:23 - nomorewest 皆様ご返信ありがとうございます。 ababさん やはりメーカーに問い合わせるべきですかね。 YKさん マウス由来のマスト細胞を使っているのですが、Sykの存在は確認されているみたいです。 IkBに関しましては未刺激のものでもバンドが非常に薄く、バックによって客観的に見てコレと言えないレベルです。 おおさん ポジコンのLysateが付いてくることがあるんですね。当方が把握している限りでは業者から渡されるのは抗体のみでした。注文するともらえたりするのでしょうか。検討してみます。 Xさん お恥ずかしながら調べてみるとPMAでSykはリン酸化されないみたですね。PMAを置く意味はなかったですが、（マスト細胞を）抗原刺激してもリン酸化のバンドが検出できず、そちらに関してはやはり不思議です。 用いている抗体はY525/526でした。リン酸化部位によって検出できるものとそうでないものがあったんですね。他の認識部位の抗体も検討してみます。 非リン酸化でも見られないのはマスト細胞では発現が少ないということなのでしょうかね。ただ現条件でもノンスペが気になり、細胞数を増やしても期待薄というかんじはしてしまいます。それでもやってみるしかないですが・・・ ntさん 検出できる方もおられるんですね。自分はマウスですが、細胞以外の違いなのか、細胞によるのか・・・ 皆さんありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6745-9 - 2018/03/07 (水) 18:12:39 - nt IκBαについては#4814なら当方では検出できています。 使っているサンプル種はラットでLPS刺激により（分解されて）バンドは見られなくなります。 ブロッキングはスキムミルクで行なっています。

(無題) 削除/引用 No.6745-8 - 2018/03/07 (水) 06:30:31 - X SYKのリン酸化は、複数のチロシン残基で起きることが知られていると思いますが、どのチロシンに対する抗体を用いていますか？　とある細胞でSYKのリン酸化を見ていますが、私が調べている細胞では、525/526番目のチロシンのリン酸化は検出できません（CSTの抗体を用いています）。一方、リン酸化ZAP70と交差反応する、SYKでは352番目のチロシンのリン酸化を検出する抗体（これもCSTの抗体です）では、リン酸化が検出（バンドのサイズとトータルSYKのリブロットでSYKのリン酸化と判断してます）されます。 この細胞にGPCRを介したシグナルを入れても、そのSYKリン酸化は全く影響されず、Fc受容体などを介した恒常的なリン酸化ではないかと考えています。質問者さんが用いている細胞では、PMAによるPKCの活性化は、検出しようとしているSYKリン酸化の上流イベントと考えられますか？　BCRのシグナル伝達などでは、むしろSYKをPKCの上流に位置付けている総説なども見かけますが、この場合はPMAで刺激してもSYKの活性化は起きないかもしれません。もちろん、細胞や刺激伝達系によっては、PKCがSYKの上流と考えられる場合もあるとは思いますが、PMA以外の刺激でどうなるか、見てみる価値はあるように思います。 書いていて見落としに気付いたのですが、トータルのSYKが検出されないとお返事されてますね。お使いの細胞種は何でしょうか？　骨髄球系やB細胞系の造血細胞ではSYKの発現があると思いますが、それ以外の細胞種だと、どうでしょうか。発現自体がない（あるいは非常に低い）可能性も否定できないので、SYKが発現している細胞種をポジコンにしてトータルのSYKから確認していく方が良いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6745-7 - 2018/03/07 (水) 03:23:59 - おお Cell Signaling technologyってポジコンになるLysateをつけてくれませんか？それで出ないなら、検出系がCell Signaling technologyで使ってるものに至らないからかもしれません。一度メーカーに相談するといいかもしれません。抗体の濃度上げるかな、、、

(無題) 削除/引用 No.6745-6 - 2018/03/07 (水) 03:19:23 - YK >[Re:4] nomorewestさんは書きました : > 失礼しました。 > 返信を読み返してみて言葉が足らなかったです。 > > ポジコンでもSykのリン酸化バンドは見られず、非リン酸化バンド自体も見られないです。 その細胞でそもそもSykは発現していないのかもしれないですね。 IkBのリン酸化に関してですが、リン酸化されるとユビキチン化による分解が行われるのでMG132存在下で実験するとリン酸化はみられるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6745-5 - 2018/03/06 (火) 21:23:16 - abab メーカーはなんて言っているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6745-4 - 2018/03/06 (火) 12:57:21 - nomorewest 失礼しました。 返信を読み返してみて言葉が足らなかったです。 ポジコンでもSykのリン酸化バンドは見られず、非リン酸化バンド自体も見られないです。

(無題) 削除/引用 No.6745-3 - 2018/03/06 (火) 10:59:34 - nomorewest YKさん ご返信ありがとうございます。 ポジコンとしてPMAを用いて刺激が入っていることを確認しております。 また、ERKのリン酸化もきれいに見られます。 ブロッキングはBSAで行っております。

(無題) 削除/引用 No.6745-2 - 2018/03/06 (火) 10:49:06 - YK ポジコンは置かれていますか？つまりそれらのリン酸化刺激が起こるような、LPS？とかでしょうか、そういったものでも見えませんか？ ブロッキング剤は何を使われていますか？スキムミルクよりはチロシンリン酸化の場合、BSAの方がおすすめされているかと思います。

Cell Signaling technologyの抗体について 削除/引用 No.6745-1 - 2018/03/06 (火) 10:36:50 - nomorewest 現在、western blottingでタンパク質のリン酸化をみる実験を行っています。 しかし、IｋBαとSykのバンドがなかなか見られません。他にERKやα-tubulinも見ており、そちらでは難なく見られるので手技に大きな問題はないかと思います。 そこで一次抗体に問題があるのではないかと思い、新しく買いなおしたもので行ったのですが見られませんでした。 一次抗体はいずれもCell signaling technologyのものを使っています。 同様の抗体を用いている方はきれいにバンドが出ているのでしょうか？ よろしくお願いします。

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