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(無題) 削除/引用 No.6756-18 - 2018/03/16 (金) 10:35:24 - mon > ところで、Cloning EnhancerはベクターとフラグメントをPCRで得た時のみ使用するものと思っていましたが違いましたでしょうか。 違います。フラグメント（vector, insert問わず）をPCRで調製した場合です。直鎖状ベクターは制限酵素処理でもPCR法でも良いと書いてありますよ。

(無題) 削除/引用 No.6756-17 - 2018/03/16 (金) 08:42:28 - たぶん monさん ありがとうございます。 特許情報を調べるということを思いつきませんでした。 勉強になります。 ところで、Cloning EnhancerはベクターとフラグメントをPCRで得た時のみ使用するものと思っていましたが違いましたでしょうか。 PCR産物ならばDpnIの切断を受けないで親プラスミドのみを破壊できますよね？

(無題) 削除/引用 No.6756-16 - 2018/03/16 (金) 07:24:14 - mon > in fusion酵素の由来、見つかった生物種の由来などは一切非公開ですよね。 ワクシニアウイルス由来DNAポリメラーゼの3’->5' exonuclease活性を利用しています(公開特許文書に記載されています）。 > クローニングエンハンサーの正体は DpnIなんじゃないかなと思います。 ベクターが切断されるのであり得ないです。 残存dNTPsをdNDPに分解するAPとsingel strand DNA（primer)に作用するExonuclease Iが含まれているかも。

(無題) 削除/引用 No.6756-15 - 2018/03/15 (木) 20:00:50 - たぶん in fusion酵素の由来、見つかった生物種の由来などは一切非公開ですよね。 でも、クローニングエンハンサーの正体は DpnIなんじゃないかなと思います。 たぶん。

(無題) 削除/引用 No.6756-14 - 2018/03/14 (水) 22:03:01 - QuikChange > 実際出来ているんだからできるんでしょう。 そうですね。でも、cccは前述のような問題があるとしか私には考えられないので、ニックの入った分子が変性して環状一本鎖になったものが鋳型になっているんじゃないかと思っているので、そのことの当否を伺いたかったのです。 シーケンスに必要な数百ntが、プラスミドの他の部分の構造を犠牲にして一本鎖になることには、特に問題があるようには思われません。（でも、この場合もニックの入った分子が解離しているのかもしれませんが。）

(無題) 削除/引用 No.6756-13 - 2018/03/14 (水) 14:04:04 - AP >前から疑問だったんだけど、cccのプラスミドを鋳型にPCR（というかプライマーエクステンション）して全長の娘鎖ができるものでしょうか。 実際出来ているんだからできるんでしょう。 かつてサンガー法でKlenowを使っていたころの話。 初期にはcccは一本鎖に熱変成しにくく立体障害もあって鋳型に使えないと言われていて、わざわざ一本鎖ファージで鋳型を調製していました。その後、cccもアルカリで強く変性するとKlenowでも鋳型に使えるということがわかって、一本鎖ファージの出番がなくなりました。 PCRの場合、反応温度が高く保たれるので、変性状態を保つのにもいいのかも。

(無題) 削除/引用 No.6756-12 - 2018/03/14 (水) 13:41:45 - 苦労人 手抜き実験さん 目からうろこです。ありがとうございます。 調整したDpnI、というのは、たとえば10ulなら、10xバッファー　1ul、DpnI適量、水をあわせて10ul、という感じでしょうか？ ウォッシュバッファーのわずかな残存はDpnI処理にあまり影響を及ぼさない、ということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6756-11 - 2018/03/13 (火) 21:26:47 - QuikChange 前から疑問だったんだけど、cccのプラスミドを鋳型にPCR（というかプライマーエクステンション）して全長の娘鎖ができるものでしょうか。熱変性して一部が一本鎖になってそこにプライマーがアニールしても、そこからポリメラーゼによる娘鎖合成が進むにつれて進行方向のhelicityがきつくなってどこかで止まるんじゃないかと思うんですけど。

(無題) 削除/引用 No.6756-10 - 2018/03/13 (火) 20:14:32 - 手抜き実験 簡略な手抜き法ですがPCR産物をタカラのカラムで精製しているなら一回目のウォッシュの後に、調製したDpnIを10ulほどたらし、室温15分放置、その後ウォッシュ二回という方法も使えます。 本日、二段片＋インバースPCRで作ったベクターをつないで、コロニーPCRをかけてみましたが12コロニー中、10個あたりでした。 PCRは20サイクル ampベクターでDH5α 回復培養は20分にしました。

(無題) 削除/引用 No.6756-9 - 2018/03/10 (土) 18:16:51 - 苦労人 APさん そんなにサイクル数を減らしても良いのですね。 幸い目的のバンドが増えていそうであることは確認できているので、思い切ってサイクル数を減らした検体を準備してみます。

(無題) 削除/引用 No.6756-8 - 2018/03/10 (土) 15:34:04 - AP 仮にスタートのプラスミドが10 ng、増幅効率100%だとして10 サイクルで10 ug、7サイクルで1 ugを超えます。理屈を逸脱した実験デザインです。PCRではそんなに増えないし（せいぜい一反応1 ug以下）、産物が増えて混み合ってきた状態でサイクルを重ねると、不正なプライミングや重合による副産物ができてきます。 また、そもそもPCRはエラーで塩基置換が起こりやすいので、増幅を目的とせず、既存のDNAをもとにコンストラクトするために行うときはサイクル数を下げます。10回でも多いくらい。

(無題) 削除/引用 No.6756-6 - 2018/03/10 (土) 14:19:33 - 苦労人 APさん ありがとうございます。 恥ずかしながら、DpnIについて無知でした。 PCRは30サイクルかけています。ただ実際、バンドの濃さからすると、25サイクルでもバンドが見えるかもしれないぐらいの印象でした。1ng中のプラスミドの個数を考えると、仰るように、バンドが見えないくらいでも十分なのですね。 次はもっとサイクル数を減らそうと思います。

(無題) 削除/引用 No.6756-5 - 2018/03/10 (土) 12:28:12 - AP DpnI使わなきゃ無理スジでしょう。キットを使わないプロトコールでも使うでしょう。 PCRは何サイクルくらいかけているのでしょうか。増幅が目的ではなくコンストラクションのためなので、できる限り少ない方がいいです。その分、テンプレートを多めに投入しますが、数十ngも入っていれば十分ですね。inverse PCR産物は電気泳動で見えないレベルでも十分。副産物ができていいるのはサイクルかけ過ぎじゃあないかな

(無題) 削除/引用 No.6756-4 - 2018/03/10 (土) 08:41:40 - 苦労人 おおさん 早速ありがとうございます。 > PCRのあとでDpnIという制限酵素を使うとPCRで増幅されたDNAだけがインタクトでのこる。 DpnI、良いですね。確かにどこかのmutagenesis kitでも使っているのを見かけたことがあった気がします。早速使ってみたいと思います。 > 思い込みとかが質問の中で折り重なって 申し訳ございません。仰るように、特に今回はInfusion用に長いプライマーを使っているので、ノンスペが出る可能性はむしろ高いかもしれません。 思い込みは良くないですね。。。 > cccになることはまずないですよ。だってプライマーの５’が合成されたDNAの３’とコばれんとにつながらないとそうはならないので。 > > アニーリングの仕方が不完全な２本鎖がある可能性は否定しませんが、伸長反応で合成しながらテンプレートの鎖とアニーリングしていくわけだから、あまりその可能性は考えなくていいんじゃないかと。 これも、普通に考えると、仰る通りだと思います。 基本的にはPCRのテンプレートに入れていたプラスミドがバックグラウンドになってしまっている、さらにPCRでは変なノンスペも出て若干混乱してしまっていた、だけだと思い直しました。 PCR後の制限酵素処理を追加して再トライしてみます。

(無題) 削除/引用 No.6756-3 - 2018/03/10 (土) 07:55:49 - おお 思い込みとかが質問の中で折り重なってお答えしにくくなっているので小出しにしますが、まあ別に思い込や勘違いがあってけしからんということではないですが、、、 ＞目的の長さのバンド（ほぼプラスミド全長と近い長さになる予定）と共に、その半分ぐらいの長さの部分に、薄くはあるものの明らかなバンドを認めました。正直なところ、きれいな？プラスミドをPCRしているのにノンスペ？ 単一のプラスミドを使ってもテンプレートのどこかに不完全でもアニーリングする可能性があるならノンスペはでるでしょう。たまに複雑な反応で配列を読んでも単純なミスアニーリングで説明しにくいことも起こったりしますし。 ＞さらに、PCRで増幅されたプラスミドがcccの様な直線以外の形態になる、 cccになることはまずないですよ。だってプライマーの５’が合成されたDNAの３’とコばれんとにつながらないとそうはならないので。 アニーリングの仕方が不完全な２本鎖がある可能性は否定しませんが、伸長反応で合成しながらテンプレートの鎖とアニーリングしていくわけだから、あまりその可能性は考えなくていいんじゃないかと。

(無題) 削除/引用 No.6756-2 - 2018/03/10 (土) 07:24:18 - おお >インバースPCRで親プラスミドを直線化する際、バックグラウンドを抑える工夫はどのようにされておられますでしょうか？特に今回の様に制限酵素処理を行う場合、それはPCRの前、後のどちらが良いなど、ありますでしょうか？ PCRのあとでDpnIという制限酵素を使うとPCRで増幅されたDNAだけがインタクトでのこる。

プラスミドの全長PCRによる直線化について 削除/引用 No.6756-1 - 2018/03/10 (土) 07:01:44 - 苦労人 Infusionを用いて新しいプラスミドを作ろうとしています。親ベクターに不要なシークエンスがあるため、そのシークエンス部分を除いた部分にプライマーを設計し、親ベクターをインバースPCRで増幅しました。 ゲル抽出、Infusion反応、トランスフォーメーション後、インサート無しのコントロールからもバックグラウンドのコロニーが比較的多く、サンプルのコロニーを8つピックアップしても全てハズレ（空の親ベクター）でした。 PCRのテンプレートとして入れた親ベクターのコンタミが主因と考え、不要なシークエンス部分のみを切る様な制限酵素2つで先に処理して親ベクターを直線化後、さらにPCRを行ったところ、目的の長さのバンド（ほぼプラスミド全長と近い長さになる予定）と共に、その半分ぐらいの長さの部分に、薄くはあるものの明らかなバンドを認めました。正直なところ、きれいな？プラスミドをPCRしているのにノンスペ？目的外のバンド？が出ること自体想定外で、テンプレートに入れた親ベクターcccと場所としては矛盾しない気もしますが、明らかに増幅されているバンドの明瞭さです。（テンプレートに入れたプラスミドは100ng以下、その1/6のみを電気泳動しています。） 質問ですが、間を空けるようにプライマーを設計したインバースPCRで親ベクターの完全長が増幅されてしまうことはありますでしょうか？（これは、プラスミドを2周する様な伸長反応が生じた後に、完全長が増幅されることもありうるのかも、とは思っています） さらに、PCRで増幅されたプラスミドがcccの様な直線以外の形態になる、ということがありうるのでしょうか？ インバースPCRで親プラスミドを直線化する際、バックグラウンドを抑える工夫はどのようにされておられますでしょうか？特に今回の様に制限酵素処理を行う場合、それはPCRの前、後のどちらが良いなど、ありますでしょうか？ 宜しくお願い致します。

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