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phospho IGF1Rの測定 トピック削除
No.6769-TOPIC - 2018/03/14 (水) 05:52:44 - mi
いつもお世話になっております。

現在ヒトT細胞におけるphospho IGF1Rの測定をFCMで行なっていますがなかなか同定できません。
実験操作としてはヒトCD3+ T細胞2x106/mLを無血清培地(RPMI1640 only)で24時間培養した後、rhIGF-1 100ng/mLで15分刺激を加えたのち既製品(invitrogen)のkitを使ってintracellular stainingをしています。

細胞株やWBなども含めて同シグナルの測定経験をお持ちの方のご意見が頂ければ幸いに存じます。よろしくお願いいたします。
　
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No.6769-7 - 2018/03/17 (土) 03:43:50 - mon
＞無血清培地(RPMI1640 only)で24時間培養した後
正常細胞なら、この条件がストレスを与えすぎていませんかね（アポトーシスを誘導しているとか）？
0.1%程度の血清を添加するとか。
(脂肪酸が付いた）BSAや脂肪酸（市販品だとCD lipid concentrate)を添加しても良いかも。さらにITSならぬTS(transferrin,Serenium)を添加するとか

(無題) 削除/引用
No.6769-6 - 2018/03/16 (金) 23:59:21 - mi
mon 様

コメント有難うございます。

細胞株ではIGF-1刺激のみで測定がなされているので他の蛋白によるエピトープのマスクの可能性はあまり考えていませんでした。
またメーカーに確認したところbufferに特にそのような添加はされていないとの事でした。
ただ御指摘のように脱リン酸化の可能性も考えて脱リン酸化阻害剤の併用も検討してみます。

それとそもそも活性化できていない可能性もあるので条件を変更して引き続きtryしてみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.6769-5 - 2018/03/15 (木) 12:03:13 - mon
EGFRは活性化するとKinaseドメインが開く(open complex)ので、IGF1RのKinaseドメインがepitopeの抗体なら、活性化＝epitopeが露出する＝検出可能になるかも。

(無題) 削除/引用
No.6769-4 - 2018/03/14 (水) 09:46:20 - mon
細胞内ドメインのリン酸化部位は、他のアクセプタータンパクとの認識・結合部位となっていますのでエピトープがマスクされている可能性があります。
常時という訳ではないでしょうが。
ウェスタンブロット法では変性させてブロットしているのでエピトープが露出しているので検出は容易です。それでも細胞抽出液を作製する場合は脱リン酸化を防ぐ試薬・操作を行います。
既製品(invitrogen)のkitがどのような組成かわかりませんが、脱リン酸化を防ぐ試薬を添加してみると良いかもしれません。
メーカーのテクニカルサービスへ質問してみることをお薦めします。

(無題) 削除/引用
No.6769-3 - 2018/03/14 (水) 06:57:05 - mi
む　様
コメントありがとうございます。説明が不十分で申し訳ありません。
IGF1Rのreceptor tyrosine kinaseのリン酸化を標的としているので刺激を加えた上でintracellular stainingを行なっていました。
受容体そのものについても別抗体を用いて染色しておりそちらは問題なく染まっています。

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No.6769-2 - 2018/03/14 (水) 06:07:54 - む
レセプターですよね。intracellular stainingでいいのですか？

phospho IGF1Rの測定 削除/引用
No.6769-1 - 2018/03/14 (水) 05:52:44 - mi
いつもお世話になっております。

現在ヒトT細胞におけるphospho IGF1Rの測定をFCMで行なっていますがなかなか同定できません。
実験操作としてはヒトCD3+ T細胞2x106/mLを無血清培地(RPMI1640 only)で24時間培養した後、rhIGF-1 100ng/mLで15分刺激を加えたのち既製品(invitrogen)のkitを使ってintracellular stainingをしています。

細胞株やWBなども含めて同シグナルの測定経験をお持ちの方のご意見が頂ければ幸いに存じます。よろしくお願いいたします。
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