BioTechnicalフォーラム [フローサイトメトリーでの膜タンパク質の検出]

フローサイトメトリーでの膜タンパク質の検出

No.6782-TOPIC - 2018/03/21 (水) 04:37:42 - コンブ

　いつも勉強させていただいております。
　過去トピックを参考にさせて頂いて、フローサイトメトリーで膜タンパク質の検出を試みておりますが結果が安定せず困っております。具体的にはPositive controlのはずの培養細胞が陰性になることがあります。

　市販のフローサイトメトリー用の抗体が一種類しかなく、もともとプロペプチド+細胞外ドメインを抗原として作製されたポリクローナル抗体なので、透過化処理せず細胞外だけを標的として使うこと自体無理があるもかも知れません。TritonX-100で透過化処理すると当然ながら陽性になります。

　下記のプロトコールで細胞外の部分のみを検出しようとしていますが、そもそも抗体（やその使用目的）が良くないのかとも考えております。
　何か御助言や御指導を頂ければ幸いです。
　

1.　1mMEDTAで37℃10分間置いた後にピペッティングして細胞回収。FACSバッファーにて洗浄。
2.　2％PFAで室温20分間固定。FACSバッファーにて洗浄を2回行う。
3.　透過化処理は行わず、ブロッキング液で室温で30分ブロッキング。
4.　APC conjugateの抗体で遮光して30分間免疫染色。
5.　FACSバッファーにて洗浄を2回行う。
6.　FACS CANTOIIにて解析。
　

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No.6782-16 - 2018/04/11 (水) 21:22:55 - コンブ

>M2様

御返事が遅れてしまい申し訳ございません。御教授ありがとうございました。

経過としてCRISPRでKO細胞株を作って、他の抗体でも確かめましたが、もともとのFlowの抗体は目的の膜表面タンパク質を検出するには向いていないと結論付けました。

(無題)

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No.6782-15 - 2018/03/23 (金) 07:15:43 - M2

もしその抗体がウエスタンで使用可能であれば、細胞表面をビオチン化し、ストレプトアビジンジーズでプルダウンしたものを、その抗体でウエスタンしてバンドが検出されれば細胞表面の分子を検出したということを言うことができますね。ファックスを使わなくてもと言う意味です。

(無題)

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No.6782-14 - 2018/03/22 (木) 18:52:59 - コンブ

>TT様
御多忙の中、早速の御対応を頂きましてありがとうございます。
やはり信頼性乏しいですかね、何となく自分も確信が持てずにいましたが…御助言感謝申し上げます。
マイナーな分子なので他の会社からの販売も少ないのですが、WBやIF用の抗体はありますので、しっかり吟味したいと思います。
良い抗体を得るものが勝者になるとはまさに本当ですね。サポートデータしっかり出したいと思います。
重ね重ね、貴重な御指導に深く御礼申し上げます！

(無題)

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No.6782-13 - 2018/03/22 (木) 18:50:59 - TT

この会社の不可解さは、標識が、FITCはいいとして、ほかはPE, APC, PerCPでAlexa Fluorとかの比較的退色しにくいケミカルダイがないところ。これはFACS専用抗体ですと言っているようなもの。その自信はどこから来るのか？会社になにかスペシャルスキルがあるのならそのような記載がwebにあってもいいはずだが、見当たらないし…

(無題)

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No.6782-12 - 2018/03/22 (木) 18:41:33 - TT

Assayproのwebを見てきました。
ポリクロナール抗体中心の製品ラインナップで、かなりの割合でE. Coli発現させたリコンビナントタンパク質を抗原としていますね。高次構造が保たれているかどうかわからないのに、おそらくすべての製品のApplicationにIF, ICC, IHC, FACSとあります。これまたおそらくすべてに"validated for specificity and sensitivity"と書いているのに、ほとんどの製品にデータがないですね。あっても、なんか非常にしょぼいFACSデータだけとか。（余談ながら昔のさんたくるつがそんな感じでしたね）
モノクロ抗体でもしっかりとした検定データ（抗体会社なり研究者なりで）がないと信用されないのに、このようなポリクロのICFCとなると、もうよほどしっかりと裏取りをしないとデータとして使えないでしょう。
とりあえずFACSだけはよくないです。WB, IF用の抗体ならあるのですか？ともかくもサポートデータを作ってください。

(無題)

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No.6782-11 - 2018/03/22 (木) 17:40:56 - コンブ

>TT様
御助言ありがとうございます。
会社はAssayProです。残念ながら、強制発現細胞の染色検定はWebでは示されていません。
ターゲット分子は文献からもある組織に特異的に発現している分子なのですが、抗体の使用目的に発現していない組織の疾患しか記載されていないので、単なる記載ミスなのか、怪しいの抗体か…。
抗原はE. Coliで作られたもので、抗体の精製方法はその抗原によるaffninity精製のようです。
ターゲット分子は細胞内でprocessingされて、他の分子とヘテロダイマーを組んで細胞表面にトランスポートされます。過去の文献からは、ペアになる分子がない場合は、細胞表面へは出られないようです。
immature formへの特異的な抗体、認識する立体構造の違いなのでしょうか…。

(無題)

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No.6782-10 - 2018/03/22 (木) 09:44:29 - TT

ターゲット分子の開示がないのでよくわからないが（うーん、MMPとかかな？）、かなり不思議。
その抗体会社もFACS用抗体としてわざわざAPC標識して売っているのなら、それなりの自信はあるようにも思われるが、あるいは逆にかなり怪しいところなのか・・・。結局のところ、よくわかっていない分子の新規抗体（しかもポリクロ）ならば、そこの会社が強制発現細胞の染色検定くらいはしてしかるべきなんだけど・・・。会社名は言えない？
抗原はE. Coliで作られたもの？Mammalian発現系ならでprocessされていないimmatureなタンパクとしてとれるのはリーズナブル？抗体の精製方法はその抗原によるaffninity精製ですか？
その分子は細胞内でprocessingされたのち、細胞表面にトランスポートされるのでしょうか？その抗体はimmature form特異的抗体とか？？

(無題)

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No.6782-8 - 2018/03/22 (木) 00:29:04 - コンブ

>う様
御助言ありがとうございます。仰る通りで、今まで他の膜表面の分子に対するFACSはプロトコール通りにやって結果も得られていたのであいまいのまま実験を行っておりました。

もともとプロペプチドも含めたドメインを含めた抗原で作られた抗体だったので、ポリクローナルの中で細胞外に対する抗体が少ないのかと考えておりました。御指摘のように、現在並行してKO株はCIRSPRで作製しております。

またウェスタンでは仰るようにたくさんバンドが出ます。あくまでサイズで、Mature、Precursorに合っているから、Workしているのかな、でも確信が持てないなと考えておりました。

293TとL cellを使って過剰発現もやっている途中でして、過去の文献から細胞表面へ出るためには他の分子も同時に過剰発現させないといけないようで時間がかかってしまいました。

〉細胞を生きた状態で細胞表面がそまらなければ、抗体がワークしないか、ものが発現してないかです。
まさに仰る通りです。それを判断するためには過剰発現とKOをまずは作り終えてからですね。

(無題)

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No.6782-7 - 2018/03/21 (水) 23:29:12 - う

>TT様の仰るように、過去トピックでも表面抗原へのFACS染色は固定は染色後にする話はあったので、トライしてみようかと思います。

それは解析を翌日などに持ち越す場合に染色後に固定するのであって、それがあなたの染色に影響するわけではないですよ？なんかきちんと理解してないっぽいですね。

細胞表面にあるドメインを免疫して得られたペプチドが、どうして細胞を透過処理しないと染まらないと考えるのか、そこが理解できません。あなたがやっていることは小学生でも疑問に思いますよ。

ポリクロでFACSは普通はあり得ないですよ。
あなた、その抗体でウエスタンやったことありますか？ポリクロはたいがい沢山バンドがでるものです。
そのバンドの中から分子量からこれだ、と決めて論文に示している場合が多いでしょ？あなたがやってること（細胞をポリクロで染める）は、分子量からも推測できないし、染まればいい、ただそれだけでしょう？それで特異性云々は KOマウスや細胞がない限りやるべきではないですよ。

まず細胞を生きた状態で細胞表面がそまらなければ、抗体がワークしないか、ものが発現してないかです。
前者を否定するのは、293Tにプラスミドを過剰発現させたら一発ですむ話ですやん。すぐですやん。そんなことも考えず、透過処理だのして抗体が無駄になって、新しく買いますってばかかと。あほかと。もうやめなよ実験。

(無題)

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No.6782-6 - 2018/03/21 (水) 23:00:42 - コンブ

>u様
御助言ありがとうございます。
一度固定なしでやってみたのですが、染まっておらずそれ以降は固定してやっております。
もう一度トライしてみようかと思います。

〉TT様
御助言ありがとうございます。
はい、BioCompareなどで探してみたのですが、FACS用抗体で市販されているものが現在使用しているものしかなく、選択肢がないのでそれを使用しております。APCで標識されたものを使用しています。

透過化処理を含めたプロトコールは会社に聞いて、会社Webで示されている透過化処理された場合の陽性細胞（293T）では陽性になることは確認いたしました。
培養細胞で表面抗原も陽性（であろう）細胞株は過去の文献やウェスタンの結果から陽性の可能性が高いと判断しております。

「表面抗原を見たいのだけど透過化処理Skipしたプロトコールはありますか？」をも聞いたのですが、「やってみないと判りませんが、とりあえず透過化処理だけ外してみたら」との回答でした。

TT様の仰るように、過去トピックでも表面抗原へのFACS染色は固定は染色後にする話はあったので、トライしてみようかと思います。

ノンスぺの可能性も否定はできないと思います。最悪なことに抗体が切れてしまい、Isotype control含めて新しいLotのものを買い、やり直しております。

(無題)

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No.6782-5 - 2018/03/21 (水) 21:17:19 - TT

FACS染色用ポリクロナール抗体というのはかなりの珍しい。APC標識したものが売っているの？それとも実は二次抗体を使っている？

(無題)

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No.6782-3 - 2018/03/21 (水) 21:07:33 - TT

APC標識抗体ということはFACS用抗体として売られているものなのですよね？
昔はタコ抗体を使用者責任という形式で売ってましたが、最近はどこの会社も染色データをTDSに示しているはず。
陽性細胞ということはどのような裏を取っているのでしょうか？
また、通常表面抗原へのFACS染色は固定は染色後なのだけど、固定を先にしてもワークする抗体なのでしょうか？DTSにそう書いてあるのですか？
あと、細胞内固定して染まったというのもノンスぺの可能性は？細胞内染色でのノンスぺはクローンによって全然違うのでアイソタイプコントールではわかりませんよ。

(無題)

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No.6782-2 - 2018/03/21 (水) 06:31:39 - u

>もともとプロペプチド+細胞外ドメインを抗原として作製されたポリクローナル抗体なので

細胞外ドメインを抗原に使っているのなら膜透過処理すら必要ないんじゃないですか。
普通にEDTAではがしたものを固定もせずそのまま染めたら染まるのでは？

フローサイトメトリーでの膜タンパク質の検出

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No.6782-1 - 2018/03/21 (水) 04:37:42 - コンブ

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