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qRT-PCRの結果が安定しない トピック削除
No.6822-TOPIC - 2018/04/07 (土) 23:57:36 - とある大学院生
いつも参考にさせていただいております。
大学院博士課程で、とあるタンパク質の機能解析を行っております。

標的タンパク質(膜タンパク)に対する市販の良い抗体がないため、組織や細胞での発現量をqRT-PCRで評価しているのですが、その結果が安定しません。

Web上のPrimer Questというツールを使って2種類のプライマーを設定し、標的タンパク質の組織特異的KOマウスから抽出したRNA→cDNAを用いてPCRを行ったところ、片方のプライマー(@)では理論的に正しい(CT値：Contorolマウス<<KOマウス)結果が得られたのですが、もう片方のプライマー(A)では不可解(ControlマウスとKOマウスで差がなく、前者のプライマーよりCTが6ほど小さい)な結果が出てしまいました。融解曲線はどちらもシングルピークでした。どちらのプライマーの配列も、Creリコンビネースによって除去されるエクソン内に設定しておりました。

はっきりとした原因がわからなかったのですが、@のプライマーには問題がなさそうだったので、@のプライマーを用いて他のサンプル(ポジコン的な意味合いで最初のPCRで使ったサンプルも入れました)を用いてPCRを行ったところ、最初のPCRでプライマーAに起こったことと全く同じことが起こってしまいました。やはり今回も融解曲線はシングルピークで、形も最初のPCRのときとほぼ同じでした。

状況的に考えて、プライマーが非特異的なものを増幅している可能性を疑っているのですが、最初に特異的(と思われる)増幅ができたサンプルでも同じことが起こっているので、どう対応すればよいかアイデアがなく困っております。ラボの先輩に聞いても同じような経験をした人がおらず、良いアイデアはもらえませんでした。
何かお気づきの点やアドバイスがあればお願いいたします。

PCR機器と条件ですが、
試薬はタカラのSYBR premix Ex taqU、PCRマシーンはBio-radです。
プライマーのTm値は55-58℃で、アニーリング温度は60℃です。
　
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(無題) 削除/引用
No.6822-4 - 2018/04/09 (月) 16:47:04 - おお
>やはり今回も融解曲線はシングルピーク
qPCRはあまりやらない方針なので的を得てないかもしれませんが、そのピークの温度に違いがあるとか見れないでしょうか？

KOしておいてqPCRで定量というのはよくやるものなのでしょうか？発現してないものを定量するという視点ではなんか変です。

組織からのRNA抽出ですがKOされるのはその組織の全部の細胞でしょうか？どういう組織でも血管が通っていて血液系細胞のあるかもしれませんし、そういうものの差でぶれていたりする可能性はどう考えていますでしょうか？

そのノンスペと思われるCT値はどれくらいですか？検出限界以下といってもいいところで増えているなら実質発現してないという判断になるし。

校正活性 削除/引用
No.6822-3 - 2018/04/08 (日) 06:59:54 - ちょこ
SYBR premix Ex taqUに使われている酵素はTaKaRa Ex Taq HSということです。
この酵素は3’→5’exonuclease活性（proof reading活性）を持っています。
proof reading活性はprimerの3'末端で特異性を確保している場合にはよくないのではないかと思われます。

primer blastで特異性を調べてみて上記の問題がありそうならばproof reading活性がない酵素を用いたリアルタイムPCRにしてみたらどうでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.6822-2 - 2018/04/08 (日) 01:02:20 - xyz
とりあえずそのPCR産物を全て電気泳動して確認しましょう。
細かい話はそれからです。

qRT-PCRの結果が安定しない 削除/引用
No.6822-1 - 2018/04/07 (土) 23:57:36 - とある大学院生
いつも参考にさせていただいております。
大学院博士課程で、とあるタンパク質の機能解析を行っております。

標的タンパク質(膜タンパク)に対する市販の良い抗体がないため、組織や細胞での発現量をqRT-PCRで評価しているのですが、その結果が安定しません。

Web上のPrimer Questというツールを使って2種類のプライマーを設定し、標的タンパク質の組織特異的KOマウスから抽出したRNA→cDNAを用いてPCRを行ったところ、片方のプライマー(@)では理論的に正しい(CT値：Contorolマウス<<KOマウス)結果が得られたのですが、もう片方のプライマー(A)では不可解(ControlマウスとKOマウスで差がなく、前者のプライマーよりCTが6ほど小さい)な結果が出てしまいました。融解曲線はどちらもシングルピークでした。どちらのプライマーの配列も、Creリコンビネースによって除去されるエクソン内に設定しておりました。

はっきりとした原因がわからなかったのですが、@のプライマーには問題がなさそうだったので、@のプライマーを用いて他のサンプル(ポジコン的な意味合いで最初のPCRで使ったサンプルも入れました)を用いてPCRを行ったところ、最初のPCRでプライマーAに起こったことと全く同じことが起こってしまいました。やはり今回も融解曲線はシングルピークで、形も最初のPCRのときとほぼ同じでした。

状況的に考えて、プライマーが非特異的なものを増幅している可能性を疑っているのですが、最初に特異的(と思われる)増幅ができたサンプルでも同じことが起こっているので、どう対応すればよいかアイデアがなく困っております。ラボの先輩に聞いても同じような経験をした人がおらず、良いアイデアはもらえませんでした。
何かお気づきの点やアドバイスがあればお願いいたします。

PCR機器と条件ですが、
試薬はタカラのSYBR premix Ex taqU、PCRマシーンはBio-radです。
プライマーのTm値は55-58℃で、アニーリング温度は60℃です。
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