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横からすみません！！ 削除/引用 No.6878-16 - 2018/05/09 (水) 14:03:01 - すみません！！ 私も大腸菌SoluBL21よりGST-protein X-His6のタンパク質の精製に取り組んでいます。 可溶性画分に欲しいタンパク質が得られています。 これらはライソザイムとTriton X-100とソニケーションにより得ました。 ソニケーションはやり過ぎず、泡だてず、氷上で行うことに注意しました。 10000g, 10 minで不溶性画分を除いた上清に、GSH-beadsを加え、一晩4度で転倒混和し、翌朝、20 mM GSHで溶出したところ、欲しいタンパク質の1%未満しかカラムに結合しておらず、ほぼ全てがカラム素通り画分に回収されてしまいました。 質問させてください！！ １ これまでGSHビーズは使用後、PBSを流し、その後、水を流し、最後に20% ethanol in waterで保存していましたが、もしかしたらビーズが非特異的なタンパク質でマスクされており、結合キャパシティが減っていたのではと考えました。みなさんは6 Mグアニジン>70% ethanol>waterで毎回ビーズを再生させていますか？ ２ His6タグも付けていますが、クルードな可溶性画分からタンデムに精製する場合、GSTよりHis6でまず精製した方が最終的な収率はあがるでしょうか？みなさんならどうされますか？？ 3 可溶性画分にかなりモノがあるのに、GSHビーズにほとんど結合しない、というのはあり得るでしょうか？つまりビーズが人喰い的にマスクされてるとかではなく、融合タンパク質の構造上の問題では？と思うのですが。。 4 ソニケーションはタンパク質を壊してしまうでしょうか？ もっと温和な条件（ソニケーションを使わない方法など）で可溶性画分を回収すれば、精製量はあがるでしょうか？ ソニケーションも30 secを数回繰り返しています。 横からすみません・・・

(無題) 削除/引用 No.6878-15 - 2018/05/09 (水) 12:47:59 - 中年 しつこくてすみません。 ＞超音波破砕はいろいろ検討した結果、十分に破砕ができているという条件で行っていますが、 とありますが、どのような方法で超音波処理を行い、どのような方法で破砕を確認しておられますか。私たちもあれこれ試したことがありますが、超音波処理のみで酵母細胞を十分に破砕することはとうとうできませんでした。 大腸菌を破砕するのに用いるソニケーターなどよりはるかに高出力の装置をお使いなのでしたら、そのせいでタンパク質が変性しているという可能性はありませんか。

(無題) 削除/引用 No.6878-14 - 2018/05/09 (水) 02:36:39 - mon > イメージし難いのですが、不溶性画分が砕けただけというのは、酵母細胞内にあったミスフォールディングしているものが破砕で外に出ただけという意味ですか？ そうです。50-100分子程度の凝集体（ウィルスサイズ？）だとすると、密度にもよりますが、通常の数時間の高速遠心では沈殿しません。

(無題) 削除/引用 No.6878-13 - 2018/05/09 (水) 00:54:27 - ちゅい monさんありがとうございます >不溶性画分が砕けただけだから、大腸菌のInculution body のような可溶化が必要になります。 イメージし難いのですが、不溶性画分が砕けただけというのは、酵母細胞内にあったミスフォールディングしているものが破砕で外に出ただけという意味ですか？

(無題) 削除/引用 No.6878-12 - 2018/05/05 (土) 13:46:18 - mon ＞超音波破砕はいろいろ検討した結果、十分に破砕ができているという条件で行っていますが、その場合どうしたらよいのでしょうか？ 不溶性画分が砕けただけだから、大腸菌のInculution body のような可溶化が必要になります。

(無題) 削除/引用 No.6878-11 - 2018/05/04 (金) 13:37:41 - 中年 酵母を超音波処理のみで破砕してるんですか。monさんがお書きになっているように酵素で細胞壁を消化するか、特殊なディタージェントを使うか、グラスビーズなどで物理的に破砕するかしないと難しいと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.6878-10 - 2018/05/03 (木) 17:05:06 - ちゅい monさん、ご意見ありがとうございます。 >可溶性画分というのは、抽出液で溶解した（マイルドな）上清でしょうか。 それとも「抽出液で懸濁」＞「超音波処理」＞遠心上清の事でしょうか。 遠心力はどの程度でしょうか。後者の場合、不溶性画分が微細に破砕されただけで、可溶性になっていない（変性状態のまま）可能性もあります。 僕が指している可溶性画分というのは、超音波処理したものを遠心分離した時の上清のことを指しています。超音波破砕はいろいろ検討した結果、十分に破砕ができているという条件で行っていますが、その場合どうしたらよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6878-9 - 2018/05/03 (木) 17:02:10 - ちゅい おおさんご意見ありがとうございます。 >強めの界面活性剤なども有効なときがあります。たとえばサルコシルとか。GSTにかけるときはたしか０．５％以下にしないとつかないとかあったはずだけど。 界面活性剤は試してみましたが、ダメでした。。。

(無題) 削除/引用 No.6878-8 - 2018/05/01 (火) 06:16:20 - mon >一部が可溶性画分に出てきていることがイムノブロットで確認できています。 可溶性画分というのは、抽出液で溶解した（マイルドな）上清でしょうか。 それとも「抽出液で懸濁」＞「超音波処理」＞遠心上清の事でしょうか。 遠心力はどの程度でしょうか。後者の場合、不溶性画分が微細に破砕されただけで、可溶性になっていない（変性状態のまま）可能性もあります。 酵母の場合、低温培養ってタンパク可溶性発現に有効だったっかな？？ 発現誘導をもっとマイルド(or短時間）にしてみては。。 （不溶性画分が多いにもかかわらず）酵母に拘る理由は何ですか。

(無題) 削除/引用 No.6878-7 - 2018/05/01 (火) 00:55:17 - おお >塩濃度は100 mMのNaClでやっています。もう少し高い方がいいですかね？ 生理的条件下で維持されているイオン結合を切るためには生理的な塩濃度（NaClで１３５mMとか）より高い塩濃度を使います。２５０とか３００mMとか場合によっては５００mMくらいのNaCl。ただしあまり塩濃度が高すぎるとデタージェントが分離してしまいます。 また、アグっているにせよ、コンプレックスであるにせよ、強めの界面活性剤なども有効なときがあります。たとえばサルコシルとか。GSTにかけるときはたしか０．５％以下にしないとつかないとかあったはずだけど。 >>カラムにつかないのはうまくフォールディングされてないとか >こういう場合、DTT以外に何か策はあるのでしょうか、、、？ 常套手段的なものはないですねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.6878-6 - 2018/05/01 (火) 00:38:49 - おお >コンプレックスの場合、イムノブロットでは高分子量のところに検出はできませんかね？ 変性しているので、コンプレックスを作るような構造が壊れていると考えるのが一般的かと思います。

(無題) 削除/引用 No.6878-5 - 2018/04/30 (月) 21:39:06 - ちゅい おおさん、ご意見ありがとうございます。 >カラムにつかないのはうまくフォールディングされてないとか こういう場合、DTT以外に何か策はあるのでしょうか、、、？ >コンプレックス形成の可能性があるなら、塩濃度を上げるとかLiClを高濃度で使うとか コンプレックスの場合、イムノブロットでは高分子量のところに検出はできませんかね？通常の分子量のところにしかシグナルは検出されておりません。塩濃度は100 mMのNaClでやっています。もう少し高い方がいいですかね？

(無題) 削除/引用 No.6878-4 - 2018/04/30 (月) 21:35:55 - ちゅい monさんご意見ありがとうございます。 >酵母細胞内で可溶性発現している確証は？？ まだまだ素人なので的外れだったら申し訳ないのですが、このタンパクの多くが不溶性画分にいってしまいますが、一部が可溶性画分に出てきていることがイムノブロットで確認できています。そのためその可溶性画分をカラムにかけているという流れです。 >破砕バッファーの組成は？DTT等は加えているのでしょうか。 バッファーは100mM Tris、100 mM NaCl、各種インヒビターとTritonを1%入れております。DTTを添加しても効果は見られなかったので、無添加となっています。 >通過画分に漏れるという表現から（proteaseの多い酵母だけど）分解はされないように見受けられますのは、ラッキーですが。。 そうです、分解は見受けられていないのでそこはラッキーだなと考えています。

(無題) 削除/引用 No.6878-3 - 2018/04/30 (月) 15:40:37 - おお カラムにつかないのはうまくフォールディングされてないとか、少数の分子間でアグっているとか、コンプレックスが形成されていてGSTの部分がコンプレックス内部にあるとか。 コンプレックス形成の可能性があるなら、塩濃度を上げるとかLiClを高濃度で使うとか（GSTカラムとの相性がわからないけど）。

(無題) 削除/引用 No.6878-2 - 2018/04/30 (月) 10:02:02 - mon 酵母細胞内で可溶性発現している確証は？？ Zymolyaseを使ってみるとか。Y-PERだったかな酵母用溶解液とかは？ 超音波処理が目的タンパクに妥当か否か。。泡立つので他のタンパクとS-S結合してしまうとか。破砕バッファーの組成は？DTT等は加えているのでしょうか。 通過画分に漏れるという表現から（proteaseの多い酵母だけど）分解はされないように見受けられますのは、ラッキーですが。。

タンパク質精製、クロマトグラフィーについて 削除/引用 No.6878-1 - 2018/04/30 (月) 00:36:30 - ちゅい はじめまして、初めて投稿させて頂きます。 クロマトグラフィーによるタンパク質精製時の質問になります。 私はグルタチオンセファロースを用いて酵母発現のGST融合タンパク質の精製を試みています。タンパク質の抽出には超音波処理を用いておりますが、どういうわけかBufferで酵母菌体を数十倍にかなり薄めてから破砕処理を行わないと、目的のGST融合タンパク質が上清に溶けてくれません。 この原因というのはどういうことが考えられますでしょうか？なかなか筋の通る理由が思いつかず投稿させて頂きました。まだまだ素人なものでどうかご教授くださると幸いです。 質問が多くて恐縮ですが、上記の理由で薄めて得た抽出液を、クロマトグラフィーにかける際、かなり通過画分に漏れてしまい、可溶化量の割には溶出することができません。このことはイムノブロットで見たものです。レジンのひび割れとかが理由ではないです。こちらは何か改善できれば、溶出量が上がるのかなと思い、質問させて頂きました。グルタチオンセファロースのマニュアルにあるDTTは試してみましたが、効果は特になかったような結果となりました。 併せて宜しくお願い致します。長文失礼いたしました。

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