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返信ありがとうございます 削除/引用 No.6882-12 - 2018/05/08 (火) 12:25:56 - mechano ANO様 > 水層の回収→イソプロ沈殿→エタノールでリンス　→RNAiso 以降全ての工程を再度施行でやりました。 > でも、エタノールでリンスを省略して、 > 水層の回収→イソプロ沈殿→RNAiso 以降全ての工程を再度施行 > ですませるときもあります。結果オーライです。 ⇒施行法ご教示頂きありがとうございます。 RNAiso以降再度施行した後はRNA量（濃度）の減少は多少ありますでしょうか。 一度持っているサンプルで施行してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6882-11 - 2018/05/08 (火) 11:39:04 - ANO 水層の回収→イソプロ沈殿→エタノールでリンス　→RNAiso 以降全ての工程を再度施行 でやりました。 でも、エタノールでリンスを省略して、 水層の回収→イソプロ沈殿→RNAiso 以降全ての工程を再度施行 ですませるときもあります。結果オーライです。

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.6882-10 - 2018/05/07 (月) 15:46:03 - mechano おお様 > たしかに混入するものによっては阻害が顕著だとおもうけど、２３０nmの吸収が絶対的な評価になり得るかどうかというのは、取ってくる材料が一定のものの中ではそうかもしれないが、それでも阻害作用を持つものが混じっているとは限らないので、、、そういう意味では培養細胞からとるRNAは私の使ってきた細胞においては２３０nmの吸収による評価はしていません。 > 一度得られたサンプルでqPCRをやってみてどれほど阻害がされて、検出を邪魔をしているのか確かめて見ればどうでしょうか？ > その上で必要なら組織の性質などからありえる混入物を念頭に改良するといいのかなと。AGPC法のあとで更にCTABなどを使った簡単な方法を取り入れるとかすればいいんじゃないかなと。 ⇒ありがとうございます。このトピの中でも230nmが続く実験で影響を及ぼさない（こともある）このアドバイスを他にも頂いておりますので、まずは今後の後学のためにもｑPCRに進めてみたいと思います。 AP様 > 多糖類も短波長の紫外線に吸光ピークがありますね。吸収効率はポリフェノールほどじゃないにしても、量が多ければそれなりに。 ⇒ありがとうございます。多糖類も短波長に吸収ピークがあるのですね。 マウスの皮膚（創傷）に多糖類が多く含有している可能性について知識がなかったのですが、調べてみると細菌がムコ多糖を産生するようで、当研究では創傷部に時々biofilm (菌の生着と思われる膜状のもの）が付着していることが あるので、それにより個体差を認める可能性を自分なりに考察してみました。 今後biofilmの量による230値の差にも目を付けていきたいと思います。 > 動物組織の場合、多糖類（グリコゲンなど）の夾雑が問題になりやすいです。 > そのためAGPC法の改変・改良法があって、説明書にも書いてあるんだけど、実施する人はあまりいないのかな？　 > プロパノール沈殿をするとき、プロパノールを減らしてそのかわりRNA precipitation sol　（クエン酸などを含む溶液）を入れるというのですけれど。 ⇒ありがとうございます。 改変・改良法について、当ラボでは実施している方はいなそうですが、 ご教示頂きありがとうございます。 一度A260/A230 の低いサンプルにおいて、改良法を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6882-9 - 2018/05/07 (月) 12:43:11 - おお たしかに混入するものによっては阻害が顕著だとおもうけど、２３０nmの吸収が絶対的な評価になり得るかどうかというのは、取ってくる材料が一定のものの中ではそうかもしれないが、それでも阻害作用を持つものが混じっているとは限らないので、、、そういう意味では培養細胞からとるRNAは私の使ってきた細胞においては２３０nmの吸収による評価はしていません。 一度得られたサンプルでqPCRをやってみてどれほど阻害がされて、検出を邪魔をしているのか確かめて見ればどうでしょうか？ その上で必要なら組織の性質などからありえる混入物を念頭に改良するといいのかなと。AGPC法のあとで更にCTABなどを使った簡単な方法を取り入れるとかすればいいんじゃないかなと。

(無題) 削除/引用 No.6882-8 - 2018/05/07 (月) 12:09:28 - AP 多糖類も短波長の紫外線に吸光ピークがありますね。吸収効率はポリフェノールほどじゃないにしても、量が多ければそれなりに。

(無題) 削除/引用 No.6882-7 - 2018/05/07 (月) 12:00:28 - AP >そのときは、AGPCで抽出して、イソプロ沈殿した後に、アルコールで洗わずに、RNAisoplusを添加して、もう一サイクル追加したら問題解決できました。 動物組織の場合、多糖類（グリコゲンなど）の夾雑が問題になりやすいです。 そのためAGPC法の改変・改良法があって、説明書にも書いてあるんだけど、実施する人はあまりいないのかな？　 プロパノール沈殿をするとき、プロパノールを減らしてそのかわりRNA precipitation sol　（クエン酸などを含む溶液）を入れるというのですけれど。

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.6882-6 - 2018/05/07 (月) 09:20:02 - mechano ANO様 > AGPC法であるタカラのRNAisoplusで動物組織からRNAをとろうとして、A230が高くて、ｃDNA合成などがうまくいかなかった経験があります。 > そのときは、AGPCで抽出して、イソプロ沈殿した後に、アルコールで洗わずに、RNAisoplusを添加して、もう一サイクル追加したら問題解決できました。 > 植物からのRNA抽出キットも購入したけれども、結局は使わないですんでしまって、試薬棚の肥やしになっています。 →ご丁寧にありがとうがざいます。 頂いたアドバイスの中で再度確認した部分があるのですが、 上記のイソプロ沈殿の後に、アルコールで洗わずにRNA iso plusでもう一サイクルと書いてありますが、 〇1回目イソプロ沈殿→RNAiso plus→クロロホルム→水層の回収→イソプロ沈殿→エタノールでリンス　 という流れでRNAiso 以降全ての工程を再度施行するとのことでしょうか。 （ホモジェナイズは不必要で沈殿物が再度RNAiso plusに溶解するのでしょうか） 〇RNAisoplus以降再度行うのはA230の高値の原因となるポリフェノールを除去する目的になりますか。 知識不足な部分も多く申し訳ありませんが、宜しく御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.6882-5 - 2018/05/07 (月) 07:46:25 - ANO AGPC法であるタカラのRNAisoplusで動物組織からRNAをとろうとして、A230が高くて、ｃDNA合成などがうまくいかなかった経験があります。 そのときは、AGPCで抽出して、イソプロ沈殿した後に、アルコールで洗わずに、RNAisoplusを添加して、もう一サイクル追加したら問題解決できました。 植物からのRNA抽出キットも購入したけれども、結局は使わないですんでしまって、試薬棚の肥やしになっています。

返信ありがとうございます。 削除/引用 No.6882-4 - 2018/05/01 (火) 13:20:37 - mechano >サンプルの濃度や吸光度の波形を知りたいですね。 →ありがとうございます。サンプルの濃度は約400ng/μl でした。波形はいつも通りのpeakが260で230が低い山形の波形でした。 > ひょっとして、今まで白色系統だったけど、今回は黒色系統でメラニンの混入が多かったりして。 → ありがとうございます。 動物種も確かに黒色系統使用しておりますが、成功した時も同種のものを使用していました。毛は剃毛しており、かつ表皮細胞はほとんど入ってないのですが、何かしらメラニンが多い部分だった可能性はあるかもしれません。 > ・メラニンなどポリフェノールの多い材料（植物、土壌など）から核酸を精製する方法が色々報告されているのでヒントがあるかも。 > ・阻害効果を中和する添加剤（たとえばPVAなど）についても報告があるのでヒントがあるかも。 > ・阻害がかかって反応効率が下がったとしても、反応は進むならそのままやってしまってもいいんじゃない？　いずれにせよ、なにかしらの方法でstandardizeするんでしょう? →ありがとうございます。 補正方法や阻害の中和剤の知識を高めつつ、おしゃられる通りに反応がすすむのであれば、良い気が致しますのでサンプルが足りない場合には、これも実験のうちとして一度やってみることも検討します。 A260/A230の値が下がらない手技を確立できるよう色々と試行錯誤してみます。

(無題) 削除/引用 No.6882-3 - 2018/05/01 (火) 12:53:24 - MTP サンプルの濃度や吸光度の波形を知りたいですね。

(無題) 削除/引用 No.6882-2 - 2018/05/01 (火) 12:53:10 - AP 230は植物の時には大事だけれど、動物の場合はそんなに関係ないともいいます。 というのも230が高いのはしばしばポリフェノール類によるもので、ポリフェノールはポリメラーゼの阻害作用が強いからです。PCRなんか全くかからなくなることも。 動物の場合、材料にする組織はポリフェノールをほとんど含まないことが多いのですが、もちろん含量の多い材料では問題になります。皮膚なんかあやしいですね。 ひょっとして、今まで白色系統だったけど、今回は黒色系統でメラニンの混入が多かったりして。 もし、そうであったなら、 ・メラニンなどポリフェノールの多い材料（植物、土壌など）から核酸を精製する方法が色々報告されているのでヒントがあるかも。 ・阻害効果を中和する添加剤（たとえばPVAなど）についても報告があるのでヒントがあるかも。 ・阻害がかかって反応効率が下がったとしても、反応は進むならそのままやってしまってもいいんじゃない？　いずれにせよ、なにかしらの方法でstandardizeするんでしょう?

RNA 抽出における吸光度（A260/A230)について 削除/引用 No.6882-1 - 2018/05/01 (火) 11:22:51 - mechano RNAの吸光度値（A260/A230 ratio）についてご意見をお伺いしたく投稿しました。 マウスの皮膚のサンプルよりRNA抽出し、その後に精度の高いものでRT-PCR施行を予定しています。 RNA抽出はAGPC法で行い、数十回抽出を行ってきて手技は大分安定してきたのですが、先日吸光度値（A260/A230)の値が低い値（1.1）が出てしまいました。（今までここまで低い値は経験は無かったです。） A260/A280 については1.7でタンパクの混入は少なそうで濃度も十分なのですが、A260/A230の値が低くでてしまい、次のRT-PCRの実験に使用できるのか わからなく（できればサンプル数が少ないので使用したいので）こちらでご相談させて頂きました。 自分なりに調べた内容では、論文では(A260/A230)は続く実験には影響が少ないとの内容もありましが、本当に影響がすくないのか続く実験に使用することが可能なのか困っています。また、A260/A230 ratioが低い場合にはフェノールの混入（残留）等が考えらるとの内容が他の論文にもあり、トラブルシュートとして（論文を参考にし）再度低温のエタノールで再度リンスし遠心し吸光度測定し直しましたが、濃度とA260/A280はさらに上昇したものの、逆にA260/A230は低下してしまいました。 自分自身でもさらに知識を高めるべきなのですが、 このような状態の場合 〇続く実験でのＲＮＡの利用は可能であるか また 〇A260/A230ratioの改善が必要な場合、その改善法はあるか をお教え頂きたく投稿しました。 無知な部分もあり恐縮なのですが、是非ご教授頂ければ幸いです。 宜しく御願い致します。

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