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(無題) 削除/引用 No.6898-10 - 2018/05/06 (日) 13:59:56 - ぽぽ おおさん いろいろとコメントいただきありがとうございます。仰るように、薬剤耐性遺伝子の場合には発現の強さにこだわったベクター設計にはなっていないかもしれないですね。 タンデムの設計では、強く発現してほしい遺伝子を上流にしたいと思います。 また私もプロメガのベクターを眺めていた際に、プロメガのベクター内にある、バックグラウンドを抑えるための転写終結配列が、私のベクターでも転写のread throughを防ぐ方法として使えないかと考えていました。手持ちにあるベクターからうまく配列をとってこれるかは分かりませんが、いくつかのベクターやゲノムの配列を見てみて、うまく使えそうな配列を検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6898-9 - 2018/05/06 (日) 10:54:57 - おお もうひとつ。プロメガのレポーターアッセイでは調べたいエンハンサーやプロモーターを挿入するルシフェラーゼのORFの上流の部分の更に直近の上流にPolyAサイトを挿入して、それより上流からおこるTranscriptionを止めてバックグランドのTranscriptionの影響を抑えていたりしますね。そういうPolyAサイト（前後）の配列なども一度チェックしてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6898-8 - 2018/05/06 (日) 10:33:57 - おお まあ一つ追加するとマーカーは発現の強さにこだわったりしてないでしょうから、ある程度干渉されてもことが足る可能性はあるかもしれません。 強い発現を期待するものを上流にするのがいいのかもしれません。ポリA直後の配列がTranscriptionの速さを低下させるような配列になっているのが理想的なPolyA付加の配列のようです。転写の停止もそういう配列によって促されるのでしょう。 また実際にゲノムからPolyA直後に次の遺伝子がコードされている部分を調べて取ってくるのももしかしたらやり方なのかもしれません。 それと思い出しましたが、大昔には背中合わせでプロモーターの部分を全く対称になるように配置して、正方向、反対方向のトランスクリプション活性が一緒として、転写後の制御が追求できるようなものを作っていた研究があったかもと思ってます。この場合転写活性が一緒で、それ以外の要因でうまく蛋白発現制御をマニピュレートできる可能性がありますね。ただ反復配列がプラスミドの作成、維持において少し障害になってしまう可能性もあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6898-7 - 2018/05/06 (日) 01:56:15 - ぽぽ APさん ありがとうございます。背中合わせが安全そうですね。 また、転写がpolyAで止まる訳ではない、というのも不勉強で認識が甘かったです。polyAが最終的にワークするとしても転写終結点はもっと下流になるのですね。 おおさん いろいろと情報をありがとうございます。特にPGKなどbidirecional activityがあるpromoterについては、その活性を有効活用するべく背中合わせにしている場合も多そうですね。 ただ仰るように、薬剤耐性マーカー入りのベクターはタンデムな物が多い印象です。また、プロメガのレポーターベクターですらタンデムになっていたりしますね。（全体的にプロメガはタンデムが好きそうです） ttps://www.promega.jp/products/vectors/reporter-vectors/nanoluc-reporter-vector-with-nf-kappab-response-element/?catNum=N1111 できれば親プラスミドをPCRしたくなく、制限酵素などの関係上、背中合わせはすぐには作れそうにはないのですが、まずはタンデム型の作成を進めながら、並行して背中合わせのものが作れないか試行錯誤してみたいと思います。 （足合わせ型はやめておきます）

(無題) 削除/引用 No.6898-6 - 2018/05/05 (土) 22:34:34 - おお たとえば薬剤耐性マーカーが入った発現ベクターをみるとpromoter1-gene1-polyA1--promoter2-gene2-polyA2が多いですが、そうでないものもありますね。 ただ、以下のURLではThe bidirectional promoter configuration takes advantage of the natural bidirectional activity of the PGK promoter. とあり、polyA＜-gene１＜-promoter1-promoter２-＞gene２-＞polyA２のコンストラクションがしめされています。ただゲノムへのIntegrationを考えているようですが。 ttps://www.systembio.com/products/gene-expression-systems/integrase-based-systems/pfc-ef1-alpha-mcs-pa-pgk-rfp-t2a-puro/ レンチなどでも見受けられますね。 ttps://www.systembio.com/shop/pcdh-ef1%CE%B1-mcs-pgk-puro-bidirectional-promoter-cloning-and-expression-lentivector/ ttps://www.researchgate.net/figure/Bidirectional-LV-IL-10-GFP-and-LV-GFP-efficiently-transduce-human-CD4-T-cells-a_fig2_225301075 今読めないけどBidirectionalなプロモーターを研究している論文もあるようです。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147619X14000274 プロモーターの活性が思うように出るかどうかは、周りの関係ない配列も影響しかねませんのでなんとも言えないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6898-5 - 2018/05/05 (土) 16:31:20 - AP transcriptional interference という現象があって tandemだったり向かい合わせだったりすると双方、あるいは一方の転写活性が落ちます。 安全なのはオーバーラップしないように背中合わせにすることですね。 転写はpoly A signalで止まるわけじゃないという事をおわすれなく。だらだら下流まで続きますから、下流のプロモータに干渉を受けるのは当然考えられます。

(無題) 削除/引用 No.6898-4 - 2018/05/05 (土) 14:00:39 - ぽぽ monさん いろいろと情報をお教えいただきありがとうございます。 質問の「発現量」の定義についてはあまり深く考えていませんでした。（mRNAの転写量＝生成タンパク量がほぼパラレルなイメージで、どちらも含むような感覚で質問していました。）すみません。最終的に得たいのはタンパクの発現なので、タンパクの発現量として考えていただいて結構です。 特に転写終結が不十分でread throughが起きることは懸念していたことでした。使用するpolyAはSV40とBGHのpolyAなのですが、大丈夫でしょうか、、。コモンなpolyAだとは思いますが、これらのpolyAを2つ、3つ連結させたベクターも見かけたりするので、1つだけではread throughが起きてしまうことも多いのでしょうか。 insulatorについては手持ちに配列がないのとベクターサイズを小さくしたいこともあり、今回はinsulatorはなしで考えています。 AAさん いろいろとデュアルベクターを調べてみたのですが、市販のものでも、タンデム型、背中（頭？）合わせ型、足（？）合わせ型と、いずれの型も散見されました。転写終結のことを考えると、AAさんがおっしゃる背中合わせ型がよいのかもしれない、と思ったのですが、逆にプロモーターが近すぎることも気になったりします。（また残念ながら今回は、プラスミドの構築のステップ上、背中合わせ型はちょっと難しく、今のところ候補からははずしています）

(無題) 削除/引用 No.6898-3 - 2018/05/05 (土) 12:04:07 - AA 勝手な印象ですが、デュアルのときのプロモーターの配置は背中合わせになっている印象があります。 polyA-ORF-promoter-promoter'-ORF'-polyA' (Aylop-FRO-retomorp-promoter'-ORF'-polyA'、と書いたほうがわかりやすい？？)

(無題) 削除/引用 No.6898-2 - 2018/05/05 (土) 10:32:16 - mon 発現量＝生成タンパク量として考えます。「発現量」はいろいろな意味を含みますので質問時は限定してください。 promoterの向きは転写量にさほど影響しないと思います。ただし２promoterが近くどちらかがGC richな配列の場合、open chromatin構造となりやすいので他者のpromoter活性が上がる可能性はあります。 またpolyA（転写終結）の強さが不十分だとread throghが起き、悪さするかもしれません。 基本的に全く２つのpromoterが干渉しないようにするにはInsulatorを挟むしか有りません。 P2Aも切断効率は100%では有りませんし、産物に余分なアミノ酸が付加されることは考慮しましょう。IRES（配列の影響が大）も同様です。 発現量の増大を見込んでいるなら、Intron、WPRE、sMAR等があります。 SV40由来polyA領域断片はLigationしづらい印象があります。

デュアルプロモーターの発現プラスミド作成 削除/引用 No.6898-1 - 2018/05/05 (土) 09:07:09 - ぽぽ 2つのプロモーター下にそれぞれ遺伝子を発現するプラスミドを作成したいと思っています。このようなデュアルプロモーターのプラスミド作成は初めてなので、いくつかお伺く存じます。 １つ気になっているのは、2つの遺伝子の向きを同じ向きにするのがいいのか、逆向きにするのが良いのか、ということです。つまり、promoter1-gene1-polyA1--promoter2-gene2-polyA2と、promoter1-gene1-polyA1--polyA2-gene2-promoter2のどちらが良いでしょうか？もしくは、どちらでも同じでしょうか？ また基本的なことかもしれませんが、例えばpromoterAが100の力、promoterBが70の力があるようなプロモーターであった場合、このようにデュアルプロモーターでプラスミドを作成する場合と、promoterA-geneA-P2A-geneB-polyAでバイシストロニックに発現させる場合で、geneA、geneBの発現量はどちらが高いものでしょうか？ （デュアルプロモーターの場合、それぞれ100、70の発現量が得られますか？またバイシストロニックの場合、geneA、geneBともに100の発現量が得られるのでしょうか？　なかなかその様な理想的なことにはならないことも多いとは思いますが、どちらの方が発現量が落ちやすいものでしょうか？） また今回作成にあたり、promoter1/2、polyA1/2はそれぞれ異なるものを選び、またプロモーター同士も干渉しないようには気をつけましたが、その他何か注意した方が良い点があれば教えていただけますでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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