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px330のインサートチェックの制限酵素 トピック削除
No.6908-TOPIC - 2018/05/10 (木) 11:56:04 - rybaonmu-chi
分子生物学初心者です。

px330(もしくはpx458)にgRNA-oligoが適切にinsertされているかチェックする際、
add-geneのHPのQ&Aでは、
You can quickly check which of your colonies carry the correct insert (gRNA) inpX330/pX335with BbsI/AgeI double digestion.
と記載されていました。

この組み合わせですが、AgeTを使う必然性はあるものなのでしょうか?
別の制限酵素を代用することは可能なのでしょうか?
 
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(無題) 削除/引用
No.6908-8 - 2018/05/12 (土) 13:41:42 - gys
px459を使っています。


羊土社の「今すぐ始めるゲノム編集」で紹介されている
変法GoldenGate法を使うと、ほぼ確実に陽性コロニーが取れます。

2個コロニーをとって、miniprepでシークエンスしています。
毎回、当たってます。

結局 削除/引用
No.6908-7 - 2018/05/11 (金) 16:00:06 - rybaonmu-chi
ApaTを使いました。
AgeTは普段使わないみたいです。
ちなみに、上司はBglUを使うことが多いようです。

(無題) 削除/引用
No.6908-6 - 2018/05/10 (木) 16:09:02 - おお
How can I quickly check if the cloning of my oligo into a backbone likePX330worked?

You can quickly check which of your colonies carry the correct insert (gRNA) inpX330/pX335with BbsI/AgeI double digestion. As a successful insertion will destroy the BbsI sites, a double digest should discriminate between positive and negative clones. Clones with insertion will show only linearized plasmid of ~8.5 kb (only AgeI will be able to cut). Clones without insertion will show a ~1kb and ~7.5kb fragment (both BbsI and AgeI will be able to cut).

https://www.addgene.org/crispr/zhang/faq/

AgeIでなくてもベクターを切って判別しやすい、BbsIのバッファーと相性がいいものを使えばいいんじゃない。入ったものはBbsIで切れないからそれで判別するということのようだから。

ありがとうございます。 削除/引用
No.6908-5 - 2018/05/10 (木) 15:42:54 - rybaonmu-chi
コロニーPCRについても勉強してみます。

(無題) 削除/引用
No.6908-4 - 2018/05/10 (木) 14:48:58 - xyz
インサートの近傍でシングルカットのサイトがあればそれでもOKでしょう。
BbsIとAgeIの組み合わせはともにNEB buffer 1で切れるという使いやすさのため選ばれたのだと思われます。

(無題) 削除/引用
No.6908-2 - 2018/05/10 (木) 13:47:40 - ポン佐
私はいつもコロニーPCRで陽性クローンをピックしています。
簡単ですよ。

px330のインサートチェックの制限酵素 削除/引用
No.6908-1 - 2018/05/10 (木) 11:56:04 - rybaonmu-chi
分子生物学初心者です。

px330(もしくはpx458)にgRNA-oligoが適切にinsertされているかチェックする際、
add-geneのHPのQ&Aでは、
You can quickly check which of your colonies carry the correct insert (gRNA) inpX330/pX335with BbsI/AgeI double digestion.
と記載されていました。

この組み合わせですが、AgeTを使う必然性はあるものなのでしょうか?
別の制限酵素を代用することは可能なのでしょうか?

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