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シーケンスがプライマーの配列 削除/引用 No.6976-5 - 2018/06/12 (火) 00:40:40 - たいぞう おお様　AP様 プライマーを設計しなおしたら、この妙な現象はなくなりました。 以前のプライマーよりバンドもはっきり出て、精製後の収量も多くなり、シーケンスもよく読めました。 つい、そこそこの結果が得られるとプライマーの設計しなおしに二の足を踏んでしまいますが、変だと思ったら、すぐ次の行動に移らなければ時間の無駄になるという当たり前のことを痛感しました。 いつも本当にアドバイス有難うございます。

シーケンスがプライマーの配列 削除/引用 No.6976-4 - 2018/06/08 (金) 00:36:00 - たいぞう おお様　AP様 いつもいつも、本当に有り難うございます。 お返事遅くなって済みません。 シーケンスの配列は、完全にプライマーの全長が繰り返されています。 綺麗なシングルピークの波形が繰り返されることもあれば、いくつかの波形が重なっていることもあります。前者では、信頼度のバーも高く一定なので、一見良く読めているように思ってしまいます。 プライマーダイマーをシーケンスしたらこんな感じなのかな？と思いましたが、 精製しているのでそれはないと思いますし・・。 どうしたらこんなことが起きるか・・・とても不思議です。 こうしたことが起きるのは特定のプライマーのみなので、設計し直してみます。

(無題) 削除/引用 No.6976-3 - 2018/06/07 (木) 10:36:50 - AP プライマーの全長がタンデムに繰り返しているのですか？ オーバーラップもなしに？

(無題) 削除/引用 No.6976-2 - 2018/06/07 (木) 06:09:42 - おお プライマー同士のミスアニーリングによる産物だと言うのは想像に難くないですが、、、 特にいつも同じプライマーを使っているなら、そういうものがコンタミしてたびたび増幅するようになってしまったかもしれません。 また、PCRの条件なども厳しくしたりしてみるのも手かもしれません。プライマーペアーがダイマー形成などをしてそういったノンスペを増幅しやすくなっているのなら、プライマーをデザインし直すのもありかもしれません。

シーケンスがプライマーの配列 削除/引用 No.6976-1 - 2018/06/06 (水) 01:58:02 - たいぞう 妙な表題で済みません。 いつもお世話になります。 DynabeadsでmRNAをつり出して、Superscrot IV Reverse transcriptaseでcDNAにして、PCRをし、E-Gel 2%アガロースゲルで泳動し、目的バンドを切り出して、LaboPass PCR kitで精製した後、Qubitで測って、シーケンスに必要な量があることを確認してから外注でシーケンスに出しています。 Qubitではいつも大変低い値しか出ないのですが、最低必要量を若干下回るような場合でもなんとか読めていました。 しかし、最近、同じ配列の繰り返しの結果が出るようになって、その配列がプライマーの配列であることに気付きました。 フォワードでは、フォワードプライマーの逆相補鎖で、リバースはフォワードプライマーの配列そのままです。 プライマーの長さの塩基配列が、延々と繰り返されているのです。 この原因は何なのでしょうか？ 同じ方法で、複数のサンプルをシーケンスに出して、こういう事態になるサンプルもあれば、しっかり読めてるサンプルもあります。 シーケンスを頼んでいる会社に聞いてみましたが、分からないという答えでした。 教えていただければ大変助かります。 どうぞよろしくお願いいたします。

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