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(無題) 削除/引用 No.6983-14 - 2018/06/15 (金) 04:14:53 - おお フィードバックありがとうございます。 へぇー拾えるレベルのLigationがおこってるのですね。

(無題) 削除/引用 No.6983-13 - 2018/06/14 (木) 21:35:29 - xyz みなさま あれから片手間にBamHI(G/GATCC)サイトとBsrGI(T/GTACA)サイトの間でligationしてみた結果が出たので紹介しておきます。 結論的には、突出末端がミスマッチしていようがligationできることもあるようです。 制限酵素処理したプラスミドを4℃で3日間（土日はサボったので）反応させて、 大腸菌コンピ50ulにligation産物4ulで、67コロニー得られ うち抽出したプラスミド12個中、9つが制限酵素カットの電気泳動で構造が目的のサイズで うち5個をシーケンスしてみると配列が GGATCA GGAACA GGTACA GGTACA GGTACA となっておりました。 通常の突出末端でのligationに比べると数十倍程度、効率が低いように感じますが、サブクローニングには問題ないレベルでligationできるようです。 恐らく今回のように突出した4塩基の両端2塩基でホモロジーがあれば、他の制限酵素の組み合わせでもligationできてしまうのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.6983-10 - 2018/06/09 (土) 03:44:49 - おお 簡単なのはそのギャップにはめ込めるような数塩基のオリゴを作ってLigationする。末端がリン酸化されていなければならないということを意識しないといけないが。

(無題) 削除/引用 No.6983-9 - 2018/06/08 (金) 10:30:03 - xyz AP様 ありがとうございます。たいへん勉強になります。 分子メカニズムの流れが分かり理解が深まりました。 シンプルにligationさせるだけなら簡単な実験なので、上手くいけばラッキーぐらいの気持ちで片手間にやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.6983-8 - 2018/06/08 (金) 09:32:33 - AP もし起こればミスマッチ修復されてどちらか一方になるでしょう。 大腸菌では複製直後のミスマッチは、鋳型鎖はメチル化を受けている、新生鎖はまだ受けていないということで見分けて、鋳型鎖の配列にあわせるようになっています。しかし、調製されたプラスミドは両鎖ともメチル化は完了しているとおもうので、ランダムになると思います。

(無題) 削除/引用 No.6983-7 - 2018/06/08 (金) 09:12:48 - xyz mon様、ギター様、おお様 貴重な情報ありがとうございます。 無理やりと書いたのは深い意味はなく、原理的には無理だけどやってみたらいけるかな、という程度のものです。 実際に実験を行ったわけではなく、サブクローニングするのに良い制限酵素サイトがないので、今回の方法を考えておりました。 というのも以前別のトピックで、本来は連結しないけどミスマッチでくっついた、というコメントがあったのを思いだしたので、やってみようかなでも本当に上手くいくのか、と疑問に思いトピックを立てさせて頂いたという経緯です。 >通常は、T4pol+dNTPsで平滑末端化して連結しますが。。 コドンのフレームシフトが起きてしまうのでなるべくそのまま連結して欲しい、という意図がありました。 >何がしたいのか不明ですが。。私ならPrimer設計してPCRで連結してしまいますが。あるいはアダプターかな。 はい。確かにPCRが確実ですよね。その方法でサブクロしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6983-6 - 2018/06/08 (金) 06:39:50 - ギター >monさん >かなりの条件が必要です（まず無理）。 が望んでいた答えでした。案外そういうことが起こる（1/1000とか）だったら、自分のプロジェクトについてかなり考えなきゃならないことが増えるところでした。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6983-5 - 2018/06/08 (金) 06:14:20 - mon 何がしたいのか不明ですが。。私ならPrimer設計してPCRで連結してしまいますが。あるいはアダプターかな。 Gibsonアセンブリー（NEB builder)でも連結されるには、かなりの条件が必要です（まず無理）。 当該制限酵素周辺15−30bpの配列が相補的である、かつミスマッチしている制限酵素部位が削られる必要があるので。

(無題) 削除/引用 No.6983-4 - 2018/06/08 (金) 05:06:28 - おお 無理やりligationとかいてますが、通常のやり方ではLigationの頻度は非常に低く、その結果Ligationされてないものが大腸菌内でつなぎ合わされたものができる可能性が多いと思います。大腸菌で繋ぎ合わすと言っても、菌体内でもその突出末端がアニールできないので末端が削られるとか何らかの加工を受けたりしてつながったものができる可能性が高いと思います。 それとも無理やりligationと言うことなので、ほんとにLigationされたものだけを回収してTransformationしたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6983-3 - 2018/06/08 (金) 03:47:58 - ギター >monさん 横からの質問になるのですが、Gibsonアセンブリーなら可能性があるとのことですが、どれ位の頻度で起こるかご存知でしょうか？過去の経験があったり、あるいは参考文献があるなら教えて頂けないでしょうか？よろしくお願いします。 >xyzさん monさんが仰るようにほとんど連結しないと思うのですが、過去に一度だけ経験があります。突出4塩基が混ざった形になっていました。突出4塩基のうち二つが相補的な場合でした（1234とあって2と4が相補的でそのまま残っていて、1と3はそれぞれの親配列（という呼び方も変だが）から受け継いだ形）。10年以上ベクター作りをしていてその一回きりです。同じ制限酵素でベクター作りをした経験がかなりありますが、そんなのを見たのは一回きりです。 片方が突出末端、片方が平滑末端が繋がってしまった経験は結構あります。やはり4塩基突出部が削られて平滑末端同士が連結した形でした。

(無題) 削除/引用 No.6983-2 - 2018/06/08 (金) 02:56:13 - mon 基本的にほとんど連結しません。Gibsonアセンブリーなら可能性はあります。 まれに、内在のNucleaseによって部分的に削られて（平滑末端に修復され）連結されるものができる可能性はあります。 この場合、様々な連結配列が生じます。 通常は、T4pol+dNTPsで平滑末端化して連結しますが。。

突出末端のミスマッチによるligation 削除/引用 No.6983-1 - 2018/06/08 (金) 00:58:29 - xyz 突出末端のミスマッチによるligation、例えばNcoI(C/CATGG)とNheI(G/CTAGC)で無理やりligationさせて大腸菌に形質転換した場合、生えてくるコロニーから得られるプラスミドの連結部位4塩基はどのような配列になるのでしょうか？ ランダムでNcoI型かNheI型のどちらかの4塩基になるのか、それとも混ざったプラスミドが得られるのでしょうか。。。

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