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(無題) 削除/引用 No.7060-10 - 2018/07/10 (火) 11:26:33 - ot 書き間違えていました。 おっしゃる通りNNKで実験しています。

(無題) 削除/引用 No.7060-9 - 2018/07/09 (月) 21:28:49 - 中年 メインの話題ではないのですが、実際にはNNNでなくNNKでやっておられるんですよね？

(無題) 削除/引用 No.7060-8 - 2018/07/09 (月) 14:43:11 - ot みなさまありがとうございます。 ご回答いただいた内容を踏まえてメーカーにも確認しつつ 考えたいと思います。 なのでこのトピックはもう少し残しておきます。

(無題) 削除/引用 No.7060-7 - 2018/07/09 (月) 12:47:22 - おお >長いほどPCRがかかりにくいというのは、「不正確な塩基の取り込みが起きて伸長が止まるから」という可能性もあると思います。 プライマーから、数ベース先でも１０ｋｂ先でも不正確な塩基が取り込まれる可能性がありますし、一時的にStallはあるかもしれませんがそのまま進んでしまうか、酵素によっては間違えた塩基を削って進むでしょうから、長いほどPCRがかかりにくいとうことのそれがどれだけ寄与しているのかと思いますが、、、 ＞ランダムに変異を導入すると、あらゆる遺伝子のあらゆる位置でその構造になりうるということでしょうか。 局所的です。そこで進みにくくなれば完全に伸びるものが極端にへる事もあるだろうし。 そのほかの理由としては塩基を変えることによってミスアニーリングを誘発したりもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7060-6 - 2018/07/09 (月) 10:25:57 - 中年 ゲル切り出しをされていたんですか？ 切り出しは全長の分子を濃縮はできるでしょうけど、完璧ではないでしょうし切り出しに伴ってニックも増えるでしょうね。短い分子は増幅効率も良いでしょうし。それらがプラスと出るかマイナスと出るかはケースバイケースでしょう。 もともと、増えるか増えないかギリギリの条件のようなので、ちょっとしたことが効いてくるんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.7060-5 - 2018/07/09 (月) 06:44:05 - mon たかだか20x20=400通りのアミノ変異導入なら、目的断片（CDS)外側のprimerも使って変異断片を作製しクローン化した制限酵素（＋DpnI)処理後ベクターにligationしてもよいのでは。

(無題) 削除/引用 No.7060-4 - 2018/07/08 (日) 21:37:48 - ot 中年様 おっしゃる通りバルクでプラスミドを調製しています。 >>最初の産物に全長ではない短くなったものが含まれていて、それが競合的な鋳型として反応を邪魔 ゲル切り出しでも取り除けないようなものが存在し、長鎖PCRの阻害の決定的な要因になったということでしょうか。 おお様 波形データの見方について初めて伺いました。ありがとうございます。 >>おそらく立体的に安定でポリメラーゼが苦手な構造になりやすい少数の塩基の組み合わせ ランダムに変異を導入すると、あらゆる遺伝子のあらゆる位置でその構造になりうるということでしょうか。 そして基本的なことなのかもしれませんが、 長いほどPCRがかかりにくいというのは、「不正確な塩基の取り込みが起きて伸長が止まるから」という可能性もあると思います。 ただ今回は鋳型が長くなっているわけではないので、この要因に、おっしゃった立体的な問題が加算的に生じたというイメージでしょうか。 PCRは最長で現在の10kbpほどしかかけたことがないのでわかりません...

(無題) 削除/引用 No.7060-3 - 2018/07/08 (日) 20:35:26 - おお もしDNAのシーケンスの波形データーを見たことがあるなら、なぜ均一なピークが出てないのかを考えるといいかなと思います。 ポリメラーゼの走りやすさにムラがあるからで、昔は配列を確認するときはAGのあとは読みにくいとか（記憶に定かじゃないので実際にAGだったかおぼえてないけど）そういうのをイチキしながら波形データーをみていました。 おそらく立体的に安定でポリメラーゼが苦手な構造になりやすい少数の塩基の組み合わせがあってそういう部分では進みにくくなるんだろうと思います。 で、そういうのも含めて（含めなくても）長いほどPCRはかかりにくくなります。１００kbでPCRがかかるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7060-2 - 2018/07/08 (日) 20:21:33 - 中年 「得られたプラスミドをテンプレートに」という箇所は、第1ステップの産物をトランスフォーメーションした変異ライブラリーからバルクでプラスミドを調製し、その変異ライブラリープラスミドを鋳型に第2ステップのPCRを行ったということでしょうか。それとも、第1ステップで変異の導入されたシングルクローンからプラスミドを調製し、それを鋳型に第2ステップのPCRを行ったということでしょうか。前者だとすると、最初の産物に全長ではない短くなったものが含まれていて、それが競合的な鋳型として反応を邪魔しているのではないでしょうか。

ランダム変異導入後にPCRがかからない 削除/引用 No.7060-1 - 2018/07/08 (日) 17:51:06 - ot 大腸菌を用いて遺伝子操作をしているのですが、 ランダム変異PCR後に得たプラスミドに、同様のPCRがかからなくなるという問題が生じています。 問題自体は解決したのですが、その理由が分からないのでご助力いただきたいです。 以下詳細です。 使用ベクターはpETで組換えタンパク質を含めて約10kbpあります。 ここに1残基の部位飽和ランダム変異を導入。 NNNを含んだプライマーを用い、インバースPCRをかけています。 ※使用ポリメラーゼの推奨は7kbpまでですが、今まで問題なくバンドは出ていたので、ポリメラーゼを変えずに実験しています。 この1残基ランダム変異遺伝子を用いて一度形質転換し 得られたプラスミドをテンプレートに、別のアミノ酸残基に同様にPCRをかけました。 しかしアガロースゲルのウェルに詰まっていたり、レーン全体がスメアだったりとバンドが得られません。 野生型の遺伝子にはPCRがかかるので、プライマーに問題ないことは確認済みで、変異導入後には周辺領域のシーケンスも確認しています。 1つ目の残基と2つ目の残基の間は500bpほど離れているので プライマーのアニーリングに直接影響があるとは考えにくいと思います。 一度周辺の1000bpほどを切り出して別ベクターに移し替えたり、プラスミドをカラム精製しても、やはり変異導入後の遺伝子のみ2つ目のランダム変異が入らなくなっています。 ※研究室全体では10箇所ほどの組み合わせを行っており、全てで同じ現象が起きています。 現在は小さなベクター(4kbp)に移すことでPCRはかかるようになりましたが、いまだに原因が分かっていません。 距離が離れた箇所にランダム変異が入ることで、何故別の場所のPCRがかからなくなるのか。 そしてベクターサイズを小さくしただけで何故それが解消されるのか。 この2点です。 よろしくお願いいたします。

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