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(無題) 削除/引用 No.7065-8 - 2018/07/10 (火) 11:48:16 - あかん おおさん、 組替えタンパク質が活性があるかどうかに関しては、ポジコンがプルダウンされることが確認されていますので、大丈夫だと思います。未知のものとも結合しうるかどうかについてはわかりませんが... 私は脳や胎児のブロックをビブラトームで切っていました。 VEGFを振り掛けると内皮細胞でリン酸化が起こり、VEカドヘリンがエンドサイトーシスするまでは見たことがあります。未固定です。脳や胎児という柔らかい組織だからなのか、うまくいっています。 他にもin situ zymographyなんかも未固定のものを使用したりはします。

(無題) 削除/引用 No.7065-7 - 2018/07/10 (火) 11:45:03 - あかん りさん、 Kdに関しては未知のものを想定しているのでなんとも言えないです。 コラーゲンのノックアウトマウスをスクリーニング組織に使用するので、まずWTとノックアウトできちんとワークするかを見ることが先決そうですね。ただノックアウトで残存するシグナルが、未知リガンドがあるという場合と、そうでない非特異的なバックグラウンドという可能性はありますね。 血小板上のタンパク質なので、細胞表面にリガンドがあることを想定しています。

(無題) 削除/引用 No.7065-6 - 2018/07/10 (火) 06:01:54 - おお その組替えタンパク質は活性がある（ネイティブ同様の構造をとっている）ことは確認されてますか？

(無題) 削除/引用 No.7065-5 - 2018/07/10 (火) 05:59:55 - おお よくわかりませんがビブラトームで固定、包埋していない生のサンプルが切れるんですか？

(無題) 削除/引用 No.7065-4 - 2018/07/10 (火) 04:51:52 - り GPVI dimerとコラーゲンの結合におけるKd値が、一般的な抗原抗体反応のKd値のレンジより高い場合は、抗体を用いた免疫染色のようにはいかないかもしれません。コラーゲンよりも高いaffinityで結合する未知のリガンドが存在すれば、話は変わってきます。 コラーゲンと結合することがわかっているので、コラーゲンが豊富に存在する組織の切片を用いて、染色可能か見てみると良いのではないでしょうか？　うまくいくなら、コラーゲン以外のリガンド探索のツールになり得る気もしますが、実際にはコラーゲンとの結合が染色のバックグラウンドになってしまうので、もう少し工夫が必要になるかもしれません。 コラーゲンは細胞外基質の主要成分ですが、新規リガンドの候補として細胞表面分子を想定する理由があるのでしょうか（ちょっと興味深いです）？　コラーゲンとは異なる組織内分布パターンを示すリガンドの探索が目的であれば、コラーゲンによるバックグラウンドは問題にならないかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7065-3 - 2018/07/10 (火) 02:10:28 - あかん おおさん。 今考えてるのはビブラトームで厚めの切片を作って、それを染めて見たいと考えています。 できないことはなさそうなのですね。ありがとうございます。 そのタンパク質は血小板に発現しています。 血小板の凝集に主に機能することが知られています。具体的には血管損傷時に基底膜下のコラーゲンにを介してGP6という血小板上の受容体を介して血小板凝集します。コラーゲン以外にもあるのではと考え、そのノックアウトマウスの組織を染めようと思っています。 >[Re:2] おおさんは書きました : > 細胞の表面にあるものを固定せずに抗体でそめて、場合によってはその後どのように細胞に取り込まれるかなど見るようなじっけんもあるので、未固定で染めるというのはできないことはないとおもいます。 > > 答えになってないですが運がよければできるし、悪ければできないとしか言いようがないですが、その組替えでつくったタンパク質自身は何処に発現してますか（外来のものでなければ）？どんな役割が想定されていますか？そういったところからの絞込みも考えていいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7065-2 - 2018/07/10 (火) 01:16:19 - おお 細胞の表面にあるものを固定せずに抗体でそめて、場合によってはその後どのように細胞に取り込まれるかなど見るようなじっけんもあるので、未固定で染めるというのはできないことはないとおもいます。 答えになってないですが運がよければできるし、悪ければできないとしか言いようがないですが、その組替えでつくったタンパク質自身は何処に発現してますか（外来のものでなければ）？どんな役割が想定されていますか？そういったところからの絞込みも考えていいのではないでしょうか？

未固定組織を組替えタンパク質で染色できるか 削除/引用 No.7065-1 - 2018/07/10 (火) 00:45:55 - あかん いつも勉強させてもらっています。 今、組替えタンパク質が手元にあります。これを使って組織染色を行い、その組替えタンパク質が結合する組織を同定し、その組織から未知のリガンドが同定できればと考えています。 そのような手法は実際可能でしょうか？論文を漁ってもにたような方法を取っている論文はありません。 これまでセルラインは10以上染めて見ましたが、どれも染まらずでした。リガンドは細胞表面を想定しています。なので、まずマウス組織をもし組替えタンパク質で染められるなら染めて見て、まずどの組織が染まるのか明らかにした上で、その組織からタンパク質なり調製し、アフィニティカラムで精製できないかと考えています。その辺りに明るい方、いらっしゃれば、コメントいただけると幸いです。 よろしくお願いします。

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