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セルライセートを室温で扱っても良いのか。 トピック削除
No.7310-TOPIC - 2018/10/12 (金) 05:03:50 - ちょもらんま
質問させてください。

細胞を1%トライトンX100で溶解しました。
この時のバッファーはPBSで、脱リン酸化酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤(カクテル)が入っています。

氷温10分静置したのちに、遠心した上清を使って、免疫沈降をしたいです。

ラボの中に大御所のラボから来られたポスドクさん(ビッグペーパ−1つに、EMBOも持っています。)が、室温で1時間ローテーションして免疫沈降としていました。

びっくりしました。なぜなら私は4度で基本オーバーナイトくらいしていましたので。

大丈夫ですかとお聞きすると、プロテアーゼ阻害剤がっつりなので、1時間でぱぱっとやれば問題ないとのことでした。


もちろんアバンダントなタンパク質だったり、分解を受けにくかったりするようなタンパク質にのみ、ケースバイケースだと信じたいのですが、こういうやり方は結構やられるもんですかね?
 
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(無題) 削除/引用
No.7310-4 - 2018/10/13 (土) 00:00:18 - fg
自分でははじめてIPする蛋白質で、どうなるかはっきりしたことがわからない状況ならば、いろんなケースを想定して万全の手順で臨むとおもいますが、とりあえずあるやり方でやって、本人的には満足いくデータがえられているならば、第3者的にはだいじょうぶかな?ということがいくつかあってもとりあえずそれでやるという場面はしばしばあるとおもいます。
4Cと比べて室温の方が蛋白質分解がおこりやすいということはあるでしょうし、大事なものが壊れてしまうことがあるかもしれません。反応中に翻訳後修飾が脱修飾されてしまうこともあるかもしれません。一方で、ラゼート中にはものすごい数の蛋白質があって、個々の蛋白質の安定性もまた多様で、弱いものからタフなものまであります。とりあえず目指すものが壊れなければ、IPしてくるという目的は達成できるわけです。
もちろん、それではうまくいかないものもたくさんあるとはおもいますのでその方法がいつでも適切ということではないのは当然ですが。

本人の気がつかないところでいろいろなものが失われたり、アーティファクトが介入する可能性は常にありますが、でも、じゃあ4Cなら避けられるかといわれるとその保証もないし(長時間の反応がかえって分解を受ける機会を増やすという見方もあります)。Bestを追求するときりがなくなるので、betterで妥協するということはだれでも経験あるとおもいます。蛋白質相手の実験は相手次第なので、「ーーーは~でなければならない」的な態度はときにマイナスに働くことがあり、対象にあわせてこちらが柔軟に対応を変えるのは大切とおもいます。

(無題) 削除/引用
No.7310-3 - 2018/10/12 (金) 09:48:37 - asan

むしろ4度o/nというのは本当のところ長すぎだし、抗体抗原反応からすればそんな長時間やらなくても普通は十分量キャプチャーできるというのは正直な話。ただ、室温でいいかどうはたとえプロテアーゼ阻害剤やフォスファターゼ阻害剤を入れてようは変わらないので検討の余地はありますが、通常の細胞内のタンパク質結合解析というのは長くすればいいというわけでもなくて生化学屋からすると本来長ければ長いほどタンパク質の結合は乖離するし、非特異的な抗体への吸着は増えるしで悪さする可能性すらあると考える人もいる。

ま、ベイトを取るだけなら1時間よりもO/Nの方がいいかもわかりませんが、通常見たいのはprotein-protein結合なのだから、抗体反応よりもはるかに剥がれやすいものが多いですよ、ということです。

自分は4度1-2時間でやって、ダメな場合にO/Nにする感じですね。室温でやるのは流石にあまりないですが、そうやるプロトコールがないわけではありません。

(無題) 削除/引用
No.7310-2 - 2018/10/12 (金) 07:42:18 - 4C O/N派
私は4CでO/Nでやる派ですが、むしろS/N比を考えると室温30分〜1時間がベストだ、という主張をされる人もいますよ。結構やられるもんだと思います。

トピ主さんはタンパクのdegradationを心配されているようですが、実際に室温一時間放置がどれ位影響するか一度試してみてはどうですか?量がすくなかったり壊れやすいものだと影響あるでしょうが、たいがい大丈夫だったりしますよ。

セルライセートを室温で扱っても良いのか。 削除/引用
No.7310-1 - 2018/10/12 (金) 05:03:50 - ちょもらんま
質問させてください。

細胞を1%トライトンX100で溶解しました。
この時のバッファーはPBSで、脱リン酸化酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤(カクテル)が入っています。

氷温10分静置したのちに、遠心した上清を使って、免疫沈降をしたいです。

ラボの中に大御所のラボから来られたポスドクさん(ビッグペーパ−1つに、EMBOも持っています。)が、室温で1時間ローテーションして免疫沈降としていました。

びっくりしました。なぜなら私は4度で基本オーバーナイトくらいしていましたので。

大丈夫ですかとお聞きすると、プロテアーゼ阻害剤がっつりなので、1時間でぱぱっとやれば問題ないとのことでした。


もちろんアバンダントなタンパク質だったり、分解を受けにくかったりするようなタンパク質にのみ、ケースバイケースだと信じたいのですが、こういうやり方は結構やられるもんですかね?

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