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メディウム交換後、継代御に1部の細胞が剥がれてしまいます トピック削除
No.7380-TOPIC - 2018/11/05 (月) 17:01:30 - フレイヤ
細胞培養を始めたばかりの大学3年生です。

現在ATDC5という細胞を培養しています。
細胞を起こしてだいたい3週間くらいで、まずは100mm dishにまき、増えてきたところで6wellに撒き直す作業を続けているのですが、wellに撒き直した段階で2日くらいすると必ずと言っていいほど右下2つ、あるいは下の段すべての細胞がうまく接着せずに死んでしまいます。
撒き直してうまく増えた場合でも、メディウム交換後にシート状に細胞が剥がれてしまい、担当教員に聞いても、実際の手技を見てもらっても原因がわからなくて困っています。

ちなみにメディウムはDMEMに10％FBSとp/sを入れたもの、細胞を剥がす酵素はトリプシンを使用しています。継代もdishのほうはうまくいきます。wellも上段は問題ないです。
メディウムとトリプシンが古いのかと思い新しいものに変えたのですが、同じ現象が起きてしまいました。

初心者ゆえの手技の拙さが原因でしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.7380-6 - 2018/11/06 (火) 12:12:15 - uno
毎回同じwellがおかしくなるなら、プレートが不良品である可能性も疑ってみては？
別のlotのプレートとか、隣の講座で使っている別メーカーのプレートを試してみたら。

(無題) 削除/引用
No.7380-5 - 2018/11/06 (火) 10:20:17 - み
>[Re:1] フレイヤさんは書きました :
> 現在ATDC5という細胞を培養しています。
> 細胞を起こしてだいたい3週間くらいで、まずは100mm dishにまき、増えてきたところで6wellに撒き直す作業を続けているのですが


この文章を読んでまず３週間も継代せずに維持しているのかと疑問に思う。
販売会社のデータシートを下にコピペしておくけど増殖速度はごぐ普通の細胞のようですね。

Split sub-confluent cultures (70-80%) i.e. seeding at 1-3 x10,000 cells/cm² using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA;CO2; 37°C subculture every 2-3 days.

(無題) 削除/引用
No.7380-4 - 2018/11/06 (火) 01:24:41 - おお
マイコプラズマがいるとか、、、

(無題) 削除/引用
No.7380-3 - 2018/11/06 (火) 00:02:37 - ea
毎回右下もしくは下段となると右手、右袖もしくはピペッターやピペットマンからの汚染が気になるところです。本当に初歩的なところで申し訳ないのですが、手をよくあらうもしくは、手袋をして培養作業をしていますでしょうか。

また、クリーンベンチの右手前側に熱源などあると6wellの中で、温度の違いができるので、それを感受して細胞が接着しないかもしれません。

もしくは、インキュベーターの開け閉めが多いラボなら、インキュベーター内で上記が起こる可能性もあります。プレートを180℃ひっくり返して培養してみるとどうなるでしょうか。

とりあえず羅列してみたので、これで解決したら幸いです。

(無題) 削除/引用
No.7380-2 - 2018/11/05 (月) 19:46:56 - AA
細胞の情報見ると、DMEM-F12培地を使うっぽいですが、
培地の問題はないでしょうか？

と、思いましたが、剥がれるWellがいつも同じなら手技が原因のような気がします。
HEKなんかもそうですが、ぎゅうぎゅうになるまで培養すると、
1箇所剥がれたところから芋づる式にシート状に剥がれることがあります。
培地交換/継代のタイミングを少し早めてはどうですか？

メディウム交換後、継代御に1部の細胞が剥がれてしまいます 削除/引用
No.7380-1 - 2018/11/05 (月) 17:01:30 - フレイヤ
細胞培養を始めたばかりの大学3年生です。

現在ATDC5という細胞を培養しています。
細胞を起こしてだいたい3週間くらいで、まずは100mm dishにまき、増えてきたところで6wellに撒き直す作業を続けているのですが、wellに撒き直した段階で2日くらいすると必ずと言っていいほど右下2つ、あるいは下の段すべての細胞がうまく接着せずに死んでしまいます。
撒き直してうまく増えた場合でも、メディウム交換後にシート状に細胞が剥がれてしまい、担当教員に聞いても、実際の手技を見てもらっても原因がわからなくて困っています。

ちなみにメディウムはDMEMに10％FBSとp/sを入れたもの、細胞を剥がす酵素はトリプシンを使用しています。継代もdishのほうはうまくいきます。wellも上段は問題ないです。
メディウムとトリプシンが古いのかと思い新しいものに変えたのですが、同じ現象が起きてしまいました。

初心者ゆえの手技の拙さが原因でしょうか？
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