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細胞分画における核小体について トピック削除
No.7647-TOPIC - 2019/02/04 (月) 13:22:08 - PKO
研究室にて培養細胞を用いた実験をしています。

細胞分画後(細胞質、膜、核可溶性、クロマチン結合核に分画)、ウェスタンブロッティングにて解析するのですが、その際の核小体タンパクの局在について疑問があります。

私の中では、核小体タンパクのほとんどはこのような分画の場合、核可溶性画分に回収されると認識しているのですが、実際はどうなのでしょうか。

メーカーに問い合わせたところ、『残念ながらSubcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cellsにおける核小体タンパク質の局在に関しては特に確認しておりません。
核タンパク質については水溶性タンパク質がNE(nuclear extract)フラクション、不溶性タンパク質がCB(chromatin-bound extract)フラクションに回収されます。』との回答でした。

また、核小体タンパクは、全て核小体DNAに結合しているものなのでしょうか。領域として存在し、そこに浮遊し局在するタンパクもあるのでしょうか。

Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells(Thermo)を用いています。
　
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No.7647-7 - 2019/02/06 (水) 17:50:43 - おお
えっと。まずどっちにあるとか割り切れる結果にならないと思うんですよね。たとえば核小体タンパクを数個リストアップしてクロマチンフラクションとNEをとってWBしてみるとあるものは１：１でとか他のものでは４：１とか。


で実験するなら実際に比較してものを言えばいいのではないかとおもいますよ。またキットではちょっとしたModificationなどしにくいので自身の理想に近いFractionationを見つけにくいという事も考慮したほうがいいのではないかと。

またこのようなFractionationはうん十年の歴史があるから調べたらある程度のCharacterizationは見つかるのではないかとおもいますよ。

(無題) 削除/引用
No.7647-6 - 2019/02/06 (水) 16:42:21 - PKO
LLPSという概念、勉強になりました。

核小体DNAに局在する一部の核小体タンパクは、クロマチン画分に溶出する見解で問題ないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.7647-5 - 2019/02/06 (水) 15:18:01 - 格さん
核小体自体は今流行りのLLPSで出来てるから、lysateを調製するときのように希釈されたら可溶性画分に来ると思う。

(無題) 削除/引用
No.7647-4 - 2019/02/06 (水) 11:04:28 - PKO
キットの引用文献を見ましたが、はっきりとした答えが得られませんでした。

不躾ですが、どなたかアドバイスをお願いします。

(無題) 削除/引用
No.7647-3 - 2019/02/05 (火) 10:29:15 - PKO
解答ありがとうございます。
また、リンクを参考にさせて頂きます。

自分の中で確固たる答えを見つけきれていませんが、考えてみます。

(無題) 削除/引用
No.7647-2 - 2019/02/05 (火) 07:14:20 - おお
>核小体タンパクのほとんどはこのような分画

殆どと言うには勇気がいりますが、RNA pol Iなどの活性は認められます。
https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/BF00229371.pdf

>核小体タンパクは、全て核小体DNAに結合しているものなのでしょうか。領域として存在し、そこに浮遊し局在するタンパクもあるのでしょうか。

DNAに結合していない場合どのようにそこにいるのかを想像してみてください。それにおいて否定的な理屈がないか考えてみてください。、、、と書いてしまったので回答を書くのは一旦控えます。

細胞分画における核小体について 削除/引用
No.7647-1 - 2019/02/04 (月) 13:22:08 - PKO
研究室にて培養細胞を用いた実験をしています。

細胞分画後(細胞質、膜、核可溶性、クロマチン結合核に分画)、ウェスタンブロッティングにて解析するのですが、その際の核小体タンパクの局在について疑問があります。

私の中では、核小体タンパクのほとんどはこのような分画の場合、核可溶性画分に回収されると認識しているのですが、実際はどうなのでしょうか。

メーカーに問い合わせたところ、『残念ながらSubcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cellsにおける核小体タンパク質の局在に関しては特に確認しておりません。
核タンパク質については水溶性タンパク質がNE(nuclear extract)フラクション、不溶性タンパク質がCB(chromatin-bound extract)フラクションに回収されます。』との回答でした。

また、核小体タンパクは、全て核小体DNAに結合しているものなのでしょうか。領域として存在し、そこに浮遊し局在するタンパクもあるのでしょうか。

Subcellular Protein Fractionation Kit for Cultured Cells(Thermo)を用いています。
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