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(無題) 削除/引用 No.7766-8 - 2019/03/14 (木) 13:08:43 - トリス >[Re:7] おおさんは書きました : > おそらくトリプシン溶液は燐酸でｐHを整えていると思います。なので１ｘを直接使うのと、１０ｘで培地で希釈するのでは、緩衝能力が違います。前者はCO2インキュベーター内では後者に比べより酸性にシフトすると思います。それがたぶん大きな違いかもしれません。トリプシンの至適ｐhは弱アルカリ性のようです。 > > 元のやり方に直すほうが得策のような気がします。あるいはCO2インキュベーターに入れて温度が上がったあと取り出して静置するとか。処理中頻繁にDishを振ると効率がよくなる事はあります。すこし１ｘトリプシンの量（Volume）を増やしてもいいかもしれません。 今は100Piディッシュで1mlでありますが、2mlまでトリプシンの量を増やすのも考えています。

(無題) 削除/引用 No.7766-7 - 2019/03/14 (木) 12:52:10 - おお おそらくトリプシン溶液は燐酸でｐHを整えていると思います。なので１ｘを直接使うのと、１０ｘで培地で希釈するのでは、緩衝能力が違います。前者はCO2インキュベーター内では後者に比べより酸性にシフトすると思います。それがたぶん大きな違いかもしれません。トリプシンの至適ｐhは弱アルカリ性のようです。 元のやり方に直すほうが得策のような気がします。あるいはCO2インキュベーターに入れて温度が上がったあと取り出して静置するとか。処理中頻繁にDishを振ると効率がよくなる事はあります。すこし１ｘトリプシンの量（Volume）を増やしてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7766-6 - 2019/03/14 (木) 12:39:19 - moz 細胞の接着には、Ca依存的なものと非依存的なものがあります。 ETDAはCa依存的な接着を阻害するので、EDTA非存在下より剥がれやすくなります。 クエン酸ナトリウムを使う場合もあります。 細胞培養用培地の方がPBSより安価なので、リンスに無添加培地をつかう理由も納得です。 ＞「トリプシンを長く処理すると細胞によくないから、3分以上には処理しないで」 一般的には正しいです。トリプシン標品(培養用の精製度はかなり低い）に含まれる他のプロテアーゼの影響もあるかもしれません。最近はTryLE Expressしか使っていないので、処理時間はルーズだな。。

(無題) 削除/引用 No.7766-5 - 2019/03/14 (木) 11:48:31 - トリス >[Re:4] おおさんは書きました : > ＞10Xを培地に希釈して使うとき > > そもそも培地にはトリプシンインヒビターが含まれるのでこの方法では無理があります。まあそれでもそのようなやり方を何らかの事情でやっているのならラボでいままでそうしてきた経験のある人に相談してください。たぶんそういうやり方をしている人はほとんどいませんので、アドバイスできる人はほとんどいないでしょう。 あ、10Xトリプシンを希釈するときにはFBSのない培地に希釈します。(処理した後にはFBSを含まれる培地を使います)そんなに希釈して使っても問題はないでしたが、1Xで買っているものが問題であります。

(無題) 削除/引用 No.7766-4 - 2019/03/14 (木) 11:39:17 - おお ＞10Xを培地に希釈して使うとき そもそも培地にはトリプシンインヒビターが含まれるのでこの方法では無理があります。まあそれでもそのようなやり方を何らかの事情でやっているのならラボでいままでそうしてきた経験のある人に相談してください。たぶんそういうやり方をしている人はほとんどいませんので、アドバイスできる人はほとんどいないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7766-3 - 2019/03/14 (木) 11:28:31 - トリス >[Re:2] mozさんは書きました : > 通常PBS-ETDAでリンスしてからトリプシン処理しています。 私のラボではリンスするときFBSのないRPMI1640を使います。(マニュアルにはPBSもありますが、使いません)それ使ってもよく作用しました。 > 5~10分CO2インキュベーターで処理する細胞もありますよ。 処理時間は細胞について違いますか? CHO細胞を使ってますが、はじめに教えた人が「トリプシンを長く処理すると細胞によくないから、3分以上には処理しないで」といいました。

(無題) 削除/引用 No.7766-2 - 2019/03/14 (木) 10:57:45 - moz 5~10分CO2インキュベーターで処理する細胞もありますよ。 通常PBS-ETDAでリンスしてからトリプシン処理しています。

トリプシンがよく作用しません。 削除/引用 No.7766-1 - 2019/03/14 (木) 10:10:51 - トリス こんにちは。 今日も細胞を育てるトリスです。 細胞たちは少し不均一なことを除くとよく育ってます。思ったより少なく育てるけど… 細胞のサブカルチャ、ハーベストのときトリプシンを使ってますが、37度で3分を置いても一部ディッシュで細胞が完全に離れません。ディッシュの半分ぐらい離れないときもあり、小さい一部分が離れないときもあります。 10Xを培地に希釈して使うときには3分、それとも1~2分でもでも全部離れましたが、同じ会社の1X製品を使うときにこんな現状を見えます。違うことなら、10XのトリプシンはEDTAがないもので、1XのトリプシンはEDTAがあります。(1Xは培地に希釈されています) こんなとき、トリプシンを少し(1~２分ぐらい)処理しても大丈夫ですか?

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