Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

死細胞をソートで分離して電顕観察 トピック削除
No.7895-TOPIC - 2019/05/16 (木) 09:12:48 - TAM
アネキシンV/PI染色でアネキシン、PIともに陽性となる細胞を分離し、後期アポトーシス(セカンダリーネクローシス)なのかプライマリーネクローシス・ネクロプトーシスなのか電顕で確認したいと考えています。FACSソートで分離しようと考えたのですが、自分で調べた限りそのような文献報告が見つかりません。技術的な問題がある(ソートで細胞が壊れる、など)のでしょうか? ご意見伺えればと思います。

この手法が導入された当時(90年代)の論文を見ても、各分画の細胞形態を電顕で確認した報告を見つけられませんでした。そのような論文をご存知の方がいらしたら、教えていただけると助かります。もし、形態学的な裏付けなくこの方法が浸透したのであれば、それも問題なような気がします。
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.7895-7 - 2019/05/17 (金) 07:15:36 - おお
https://www.researchgate.net/publication/13190301_Flow_cytometric_scoring_of_apoptosis_compared_to_electron_microscopy_in_gamma_irradiated_lymphocytes

こういう手もあるかな

(無題) 削除/引用
No.7895-6 - 2019/05/17 (金) 06:56:21 - TAM
おおさん、お手数かけて申し訳ありません。自分で調べても引っかかってこなかったのですが、両論文とも非常に興味深いです。本当にありがとうございます。

最初の論文は残念ながらフルで見れる環境にありません。アブストラクトを見る限り、少なくともアネキシン陽性細胞についてはソートして電顕観察しているようですね。結論から察するに、放射線照射のリンパ球では、アネキシンやTUNEL(DNA fragmentation)がプライマリーネクローシスでも陽性になり得るようで、我々の実験結果と合致するように思います。タダで読める方法がないか、ちょっと探してみます。

2本目の論文はPMCなので、全部読めました。方法論としては、普通にソートして標準的な手法で電顕にかけているように読めますが、PI陽性の細胞は分離されていないようです。この論文で分離されている「アネキシン陽性PI陰性」細胞は、アポトーシスの特徴を全く示さない腫瘍細胞(グリオブラストーマの初代培養)のようで、ソートによる形態への影響はあまりないのかもしれません。Resultsの記載では、ソート後リカバリーのための培養を経て電顕にかけたとあるのですが、マテメソではソート直後に直接電顕用の固定を行なったと書かれており、実験方法の詳細についてははっきりしないところもあります。いずれにせよ、「アネキシン陽性PI陰性」の表現形だけでアポトーシスと短絡的に結論するのは危険である事は理解できました。どうもありがとうございます。

我々の実験でソートしてみるかどうかは、来週、FACSファシリティ、EMファシリティの責任者と話し合って決める事になりました。それまでに、自分でももう少し文献を探してみます。

(無題) 削除/引用
No.7895-5 - 2019/05/17 (金) 01:56:50 - おお
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3175029/
これもかな

(無題) 削除/引用
No.7895-4 - 2019/05/17 (金) 01:53:58 - おお
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1065699598902463
これってソートしてからEMで見てませんか?

(無題) 削除/引用
No.7895-3 - 2019/05/16 (木) 21:16:03 - TAM
>[Re:2] 独り言さんは書きました :
> 古典的には、アポトーシスだけ誘導する条件、ネクローシスだけ生じる条件などで細胞を準備して、そのまま細胞集団を電子顕微鏡で観察したときに、多く見られる細胞形態をアポトーシスとして定義したり、よりスペシフィックには免疫電顕やCLEMなどで特定の蛍光をもつ細胞を顕微鏡下で特定して、電子顕微鏡観察していると思うので、ソートした分画を観察する必要はなかったのだと思います。

どうもありがとうございます。我々の実験でも、まずはバルクで、アポトーシスとして矛盾しない結果(アネキシン、subG1、など)を得た後、確認で電顕を見たら、ネクローシスぽい細胞ばかりだった、という経過です。我々が使っている細胞でアネキシンやsubG1の表現型が何を意味するのかハッキリさせる為に、このような実験を考えています。

確かに、CLEMの論文は色々出てますね。技術的なハードルはかなり上がりますが、最初からCLEMでアプローチした方が良いかもしれませんね。アポトーシスやネクロプトーシスの阻害剤の併用も合わせ、検討してみます。助言いただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.7895-2 - 2019/05/16 (木) 17:46:30 - 独り言
死細胞をソート後に観察できるかわかりませんが、

古典的には、アポトーシスだけ誘導する条件、ネクローシスだけ生じる条件などで細胞を準備して、そのまま細胞集団を電子顕微鏡で観察したときに、多く見られる細胞形態をアポトーシスとして定義したり、よりスペシフィックには免疫電顕やCLEMなどで特定の蛍光をもつ細胞を顕微鏡下で特定して、電子顕微鏡観察していると思うので、ソートした分画を観察する必要はなかったのだと思います。


なのでソートした死細胞を観察したいのであれば、同じ手法を使っている論文をがんばって探すのがよいです。

死細胞をソートで分離して電顕観察 削除/引用
No.7895-1 - 2019/05/16 (木) 09:12:48 - TAM
アネキシンV/PI染色でアネキシン、PIともに陽性となる細胞を分離し、後期アポトーシス(セカンダリーネクローシス)なのかプライマリーネクローシス・ネクロプトーシスなのか電顕で確認したいと考えています。FACSソートで分離しようと考えたのですが、自分で調べた限りそのような文献報告が見つかりません。技術的な問題がある(ソートで細胞が壊れる、など)のでしょうか? ご意見伺えればと思います。

この手法が導入された当時(90年代)の論文を見ても、各分画の細胞形態を電顕で確認した報告を見つけられませんでした。そのような論文をご存知の方がいらしたら、教えていただけると助かります。もし、形態学的な裏付けなくこの方法が浸透したのであれば、それも問題なような気がします。

7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。