Bio Technical フォーラム

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Flag tagとenterokinase トピック削除
No.7976-TOPIC - 2019/06/13 (木) 03:32:32 - saki
現在あるタンパク質を大腸菌で発現させ、精製しています。
GSTタグがあり、enterokinaseの認識配列（DDDDK）、そして目的たんぱく質、最後にFlagタグが付いています。
GSHで精製後、enterokinaseでGSTを切り離します。
FlagタグはDYKDDDDKで、Kが最後のアミノ酸です。
反応前と反応後のサンプルのウェスタンをGST抗体でウェスタンすると、予想通りのバンドのシフトが見られましたので、きちんと切れていることがわかりました。
ところがそのサンプルをFlag抗体でウェスタンすると、反応前は目的のサイズにはっきりとバンドが見れれますが、反応後に完全になくなっています。
切れたタンパク質の分子量は30kDaほどですので、ウェスタンが難しいとも思えないです。Flag中には認識配列がありますが、Kの後ろで切れるので、問題ないと思っていましたが、何が起こっているのか不明です。
現在CBBで染色する予定ですが、なにか思い当たることがありましたら教えていただければ嬉しいです。
　
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(無題) 削除/引用
No.7976-3 - 2019/06/13 (木) 11:29:59 - おお
なんとなく私もそんな可能性を考えつつ、抗体はどの（どこの）抗体を使っているんだろうと思っていました。
またこういうのもあります。
https://www.neb.com/products/p8070-enterokinase-light-chain#Product%20Information
It will sometimes cleave at other basic residues, depending on the conformation of the protein substrate.

DYKの上流がDリッチでそこで切れてるとか、、、
あり得るかどうか検討も付きませんが

たまにやるミスが、扱っている蛋白の中にDDDDKがあるケース。

(無題) 削除/引用
No.7976-2 - 2019/06/13 (木) 10:51:27 - AP
これはないかと思うけれど、使っている抗体がC末端のFLAGを認識しないタイプ

Flag tagとenterokinase 削除/引用
No.7976-1 - 2019/06/13 (木) 03:32:32 - saki
現在あるタンパク質を大腸菌で発現させ、精製しています。
GSTタグがあり、enterokinaseの認識配列（DDDDK）、そして目的たんぱく質、最後にFlagタグが付いています。
GSHで精製後、enterokinaseでGSTを切り離します。
FlagタグはDYKDDDDKで、Kが最後のアミノ酸です。
反応前と反応後のサンプルのウェスタンをGST抗体でウェスタンすると、予想通りのバンドのシフトが見られましたので、きちんと切れていることがわかりました。
ところがそのサンプルをFlag抗体でウェスタンすると、反応前は目的のサイズにはっきりとバンドが見れれますが、反応後に完全になくなっています。
切れたタンパク質の分子量は30kDaほどですので、ウェスタンが難しいとも思えないです。Flag中には認識配列がありますが、Kの後ろで切れるので、問題ないと思っていましたが、何が起こっているのか不明です。
現在CBBで染色する予定ですが、なにか思い当たることがありましたら教えていただければ嬉しいです。
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