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(無題) 削除/引用 No.8235-5 - 2019/09/08 (日) 03:16:33 - mon EF1aプロモーターが弱いなら、E2Fプロモーターも弱いでしょうね。 EF1プロモーターもGC richな1st イントロンを入れると数倍の増強が見込まれるようですが。 CMV(CAG)プロモーターを使うなら、メチル化を防ぐUCOEエレメントを繋ぐと良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8235-4 - 2019/09/07 (土) 20:12:14 - ken monさん、 いろいろなご指摘ありがとうございます。 自作dual expression vectorではそれぞれのカセットの影響を考慮して、CMV-HCとCMV-LCの向きを同じものと逆のものを作ってみましたが、効果はなかったですが、insulatorの可能性はまだあると思っています。 IRESも現在考えているところですが、T2Aなどは余分なものを付けたくないので試していません。同じpromoterを使うことは当初から懸念していたのですが、この細胞ではCMVは強かったですが、EF1aとPGKは弱いため、結局CMVかCAGを使うことを検討しています。E2F promoterは今まで試したことはないです。調べてみます。 おおさん、 この細胞はlarge Tのtransformではないので、使えないと思っています。 >[Re:2] monさんは書きました > CMVエンハンサーが干渉している可能性があります。Insulatorで挟むと良いようです。 > IgGでは、IRES, P2A(ちょっと驚き）を利用してmonocisronicに発現させた報告があります。 > この場合、H鎖とL鎖の発現量が最適比にならない可能性もあります。 > 安定発現株でのCMVプロモーターは徐々に不活性化するので、GC-richなE2Fプロモーター(+ イントロン+WPRE）を利用することが多いようです。 > また、DHFR遺伝子等を利用した遺伝子増幅によりIgG発現量の増大を試みることも定法です。

(無題) 削除/引用 No.8235-3 - 2019/09/07 (土) 15:27:39 - おお SV40oriあるなしの違いとか？

(無題) 削除/引用 No.8235-2 - 2019/09/07 (土) 13:11:45 - mon CMVエンハンサーが干渉している可能性があります。Insulatorで挟むと良いようです。 IgGでは、IRES, P2A(ちょっと驚き）を利用してmonocisronicに発現させた報告があります。 この場合、H鎖とL鎖の発現量が最適比にならない可能性もあります。 安定発現株でのCMVプロモーターは徐々に不活性化するので、GC-richなE2Fプロモーター(+ イントロン+WPRE）を利用することが多いようです。 また、DHFR遺伝子等を利用した遺伝子増幅によりIgG発現量の増大を試みることも定法です。

Fabの発現 削除/引用 No.8235-1 - 2019/09/07 (土) 00:55:45 - ken 現在Fabの発現を試みていますが、困っています。 HCとLCをある細胞に1：2でトランスフェクションして、ELISAかウェスタンで培養上清を取ってみると、強い発現が確認できます。ともにCMVプロモータを使っています(pcDNA)。 トランスフェクション時のプラスミドの割合をHCとLCで1：1にすると培養上清中の発現が半分ぐらいになりますので、割合が重要だとわかりました。ウェスタンでは還元状態ではほぼ同じ分子量で、今持っている抗体ではHCとLCは区別付きません。 この安定株を作成する必要があり、CMVが2つあるdual expression vectorにHCとLCを入れて一過性で発現すると、どういうわけか上清中の発現が1/10以下になってしまいます。 3'UTR sequenceなどの影響かと思い、元の発現ベクタ(pcDNA)のCMV-HC-UTR配列を切ってLC-pcDNAに貼り付け、dual expression vectorを自作しても発現は1/10以下です。HCとLCの比率が影響しているのかと思い、トランスフェクション時にこの自作duel expression vectorとHC-pcDNAやLC-pcDNAを割合を変えて混ぜても全く上清中の発現がよくならなかったです。 一応、この自作vectorで安定株を取りましたが、発現は低いままで使い物になりません。 現在、pcDNAの選択マーカを変えてHC-pcDNAとLC-pcDNAの安定株を2段階で取る方法を考えていますが、なぜdual expression vectorを使うと、このようなことが起こったのか、不思議です。トランスフェクション効率がvectorのせいで悪いのかと思いましたが、ともに混ぜたGFP plasmidで見る限り、問題なさそうです。 どなたかアイデアがある方がいらしましたらお知恵をお借りできればと思っています。

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