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(無題) 削除/引用 No.8725-4 - 2020/03/21 (土) 08:39:45 - TK-1 inpsectorの色の指定はなんとでも変えられます。そこにアサインされているdetectorのフィルターがどうなっているかわかれば使えるかどうかはわかります。多くの場合のPE-Cy7なら780/60くらいのbandpassが入っているはずです。 PIの発光は610nmくらいがピークですがかなりブロードなので、PIからの他のディテクターへの漏れこみはかなり大きいです。他の蛍光からPIのディテクターへの漏れこみさえなければPIを最初にゲートアウトすればそれで済むはずです。レーザにもよりますが、それが嫌ならDAPIや7-AADなどを使えばいいです。Ter119はよく染まりますが、正常マウスの脾臓では陽性細胞の率は低いです。ちゃんとポジコンを取りたければ骨髄細胞を使ってください。

(無題) 削除/引用 No.8725-3 - 2020/03/20 (金) 16:45:04 - asan アスタリスクの意味は自分もわかりませんが、PIは通常ネガティブゲートなのでPE-cy７に漏れ込むことはあまり考えなくてもいいかもしれません。 ただし、PIに漏れる場合はPE-cy７が陽性の細胞をPIのネガティブゲートでのぞいてしまってる可能性はあるので注意が必要だと思います。 単染色を取得してるなら、オートコンペンセーションである程度補正できませんかね？ すでに一度取得したデータがあるなら再解析してみれば明らかに漏れ込んでたりする場合はわかると思いますが。単染色がなくても、biexponentialにしたら漏れ込みがひどい場合は明らかにわかります。

(無題) 削除/引用 No.8725-2 - 2020/03/20 (金) 07:33:41 - M どういう状況なのか、今一つピンとこないのですが、単染色のサンプルが染まってなければ、補正はできません。「PIと重なる」かどうか以前の問題のような気がしますが。 補正用に、PECy7-TER119単独で染色したサンプルを準備したと思うのですが、このサンプルを無染色のサンプルと比べた場合に、シフトが全くみられないのであれば、何らかの根本的な問題があるのでしょう。溶血するとTER119の検出は難しくなりますが、未溶血との事なので他の問題でしょう。TER119はコラゲナーゼ処理に対して耐性ですが、他の酵素に対してどうか私は知りません。もし何か特殊な酵素を使って処理しているのであれば、酵素を使わないで準備した細胞と比較してみると良いかもしれません。 未溶血の脾臓細胞の場合、TER119陽性の細胞は主に赤血球になります。Foward scatterでゲートをかける時に赤血球をゲートアウトしてないか、確認はしておいた方が良いかもしれません。 染色がワークしている場合、PECy7からPE検出器への漏れこみがあるでしょうから、PIとはかぶる可能性はあると思います。LSR IIという事ですが、レーザーはどうなっているのでしょう？　 **PE-Cy7**のアステリスクの意味はよく分かりません。質問の趣旨から外れてたら、ごめんなさいね。

マルチカラーフローサイトメトリー （LSR2） 削除/引用 No.8725-1 - 2020/03/18 (水) 08:38:18 - コロ いつも勉強させてもらっています。 わたしはLSR2を用いて、マウスリンパ節細胞を解析しています。 使用しているものは、酵素的にシングルセルにしたリンパ節細胞を抗体で染め上げ、最後にPIを加えて死細胞を染めています。 結論から言うと、FITC, PI, APC, PECy7の4色なのですが、補正の時点でPIとPECy7が重なってしまうとのことでした。その理由を探ると気づいたのですが、補正のチューブ（脾臓細胞を使用。未溶血）のうちはPECy7-Ter117が全く染まっていませんでしたので、そもそも補正がうまく出来ていない可能性が高いです。 この抗体は免疫組織染色でもよく使っているので、ワークするはずです。 Ter117クローンといえば赤血球の抗体として長く使われてきた歴史もあります。 抗体は昨年末に購入したばかりです。 おかしいな、使えるはずなのにな、、と探っていると、inspectorのところでPE-Cy7を選択する際に、**PE-Cy7**と、アスタリスクで挟んだ書き方になっていました。まるで、この蛍光を検出しようとするときには機器の設定を気をつけなさいと言わんばかりに。 ただ推測の域を出ません。 このアスタリスクの意味をご存知の方がいらっしゃいましたら、ご指導いただけませんでしょうか？ とても初歩的なことで恐縮しています。よろしくお願いいたします。

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