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assanさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.8948-7 - 2020/07/01 (水) 12:55:46 - ねこ asasn さん、コメント有り難うございます。 > そもそもRNAseqのshort readでマッピングされてるもの自体も本当に目的のlnc RNAの量だけを反映してるのかというあたりから議論になってもおかしくないのでは？ 私もそう思います。 ただ、ポスターのみですが、ある発表で、そのlncRNAのqPCRが行われていました。 そのfirst authorにResearchGateからメッセージを送ってprimer配列を教えてもらおうとしたのですが、返事がありません。。。 >Primer blastなどの機械のパラメーターが厳しすぎて条件に適したものが見つかってないだけというきもしますが、、、 設定をいろいろいじってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.8948-6 - 2020/06/29 (月) 10:54:35 - asasn 片方がmatchしたからって、ampliconでサイズも全く一緒で増幅可能な場所がRNA上に複数あるってのはちょっと考えにくいですけどね。transposonとかpseudogeneやバリアント特異的な配列を増やしたいなどの特殊なケースはともかく。 どうしても領域全体が同じ配列という場合はそもそもRNAseqのshort readでマッピングされてるもの自体も本当に目的のlnc RNAの量だけを反映してるのかというあたりから議論になってもおかしくないのでは？ Primer blastなどの機械のパラメーターが厳しすぎて条件に適したものが見つかってないだけというきもしますが、、、。もちろんreal time 用としては質の良くないprimerしか作れない可能性はありますけど。

(無題) 削除/引用 No.8948-5 - 2020/06/27 (土) 11:27:20 - ねこ > ターゲットに繰り返し配列があるということですか？ ターゲットの中に、1塩基違いとかでアニールする部分が4カ所くらいあります。 確かに、内部だけなら定量性は保たれそうですが、あいにく、BLASTかけると、X染色体とか、Y染色体とか、全然関係ない部分にも配列100%マッチの部分があるようで、困っていました。

(無題) 削除/引用 No.8948-4 - 2020/06/27 (土) 11:24:52 - ねこ おお さん、コメント有り難うございます。 >Primer　Blastで増幅されそうな配列があるかどうかを確認するほうがいいと思う。そのときの対象は染色体DNAよりターゲットの生物種の生物種のRNAのデーターベースにを使うといいともう。 Primer Blastにかけようと思ったのですが、UCSC genome browserで検索したところ、Primer Blastで使えるaccession numberなどが無く、諦めてしまっていました。 ただ、その後、ダウンロードできたDNA配列(exon, intron不分離）と、genome browserの配列と照合して分かったRNA配列があり、exon, intronの場所が分かるので、自分でFASTA形式にすれば良いですね。 Primer Blastにかけてみます。 > ターゲットのRNA全長でブラストなどをかけてホモロジーをもつRNAを抽出してアライメントしておくと何処にプライマーが設定できそうかあたりがつけれる。 なるほど。そういった手法は初めて聞きました。勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.8948-3 - 2020/06/24 (水) 11:17:58 - おお >どこを取っても4カ所くらいにanneal ターゲットに繰り返し配列があるということですか？それが全く同じ配列の繰り返しなら、ターゲットないの複数箇所がかかっても定量ができそうな気もします。近いところにリピートがあって２つつながったものが出てこなければだけど。

(無題) 削除/引用 No.8948-2 - 2020/06/23 (火) 14:52:51 - おお ３’末端がターゲット以外のシーケンスでは一致しないこと。また、他のところにもミスマッチがあるときはあまり長すぎないほうがいいと思う。 片方のプライマーがアニーリングしても、もう一方がアニーリングしなければ増幅しないのでPrimer　Blastで増幅されそうな配列があるかどうかを確認するほうがいいと思う。そのときの対象は染色体DNAよりターゲットの生物種の生物種のRNAのデーターベースにを使うといいともう。 ターゲットのRNA全長でブラストなどをかけてホモロジーをもつRNAを抽出してアライメントしておくと何処にプライマーが設定できそうかあたりがつけれる。

lnc RNA のqPCRプライマー設計 削除/引用 No.8948-1 - 2020/06/23 (火) 12:12:16 - ねこ scRNA-seqの結果から、研究テーマの関連遺伝子として目を付けたlnc RNAがあり、qPCRで評価しようと考えています。 ところが、qPCRのプライマーをbenchlingで設計しようとすると、「候補が見つかりません」と表示され、自分でsnap geneで設計しようとすると、確かに似たような配列が多いためどこを取っても4カ所くらいにannealしてしまいます。 BLAST検索すると、他の染色体の部位にもかなりヒットしてしまいます。 このような遺伝子のqPCRにおいて、設計のコツなどありましたら、お教え頂けないでしょうか。 宜しくお願いします。

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