全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9043-4 - 2020/07/30 (木) 05:17:04 - M ちなみに、KRAS-G12D変異の場合、過剰発現により細胞増殖が止まる可能性があり、実験にならないリスクもある事も考慮しておいた方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.9043-3 - 2020/07/30 (木) 05:13:18 - M 少なくともマウスでは、KRAS-G12変異の場合、過剰発現とノックインでは下流シグナルの活性化や表現形に違いがある事が示されていますので、特に初期病変のモデルにしたい場合は、ノックインの方が良いと思います。もう一つの遺伝子については、その特徴に応じて考えるべきと思われ、詳細が不明なのでコメントしかねます。 CAS9ノックインの系がきちんと走っているラボで、ある程度のノックイン効率が得られる事が経験的に期待できるのであれば、これでトライしてみてはどうでしょう？　ただし、その不死化細胞がシングルセルで培養可能である事が条件になります。１クローンでは、導入遺伝子によるトランスフォーメーションなのか確定でいないので、実験目的によっては複数のクローンで解析した方が良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9043-2 - 2020/07/29 (水) 12:52:05 - TCP 私ならまずショートカット2で進めます。 内在性遺伝子座にノックインはまだそれほど効率的ではないでしょうし、クローンをセレクションする手段がなければ気の遠くなる方法論だとは思います。 ノックインがうまくいったクローンが周りに比べて増殖能が凄まじければ、それを根拠にスクリーニングすることは可能かもしれませんが、どのように正攻法を進められるのか、それが可能かどうかで考えてもいいかもしれません。 2の方法は簡便ですし、昔から行われてきている方法論で私からすればそちらが、過剰発現にはなりますが、わたしにとっての正攻法になります。

KRAS遺伝子変異導入 削除/引用 No.9043-1 - 2020/07/29 (水) 08:22:33 - もも とある不死化された人の正常細胞(疑似正常細胞という言い方が正しいでしょうか)にKRAS遺伝子変異ともう一個別の遺伝子変異を導入し、前癌病変を作成したいと考えております。 この場合、どういった遺伝子導入方法が考えられますでしょうか。 CAS9等で1塩基置換を導入して、クローンをセレクションいくのが最も正攻法だと思いますが、1個のプラスミドにKRAS-mutを含む2個目の遺伝子を導入して、同時にトランスフェクションするという方法も検討しているのですが、こういう場合何を基準に決定したらいいのでしょうか。当然pathwayの活性化は同じかもしれませんが、導入方法によって何らかの表現型の違いも生まれるような気もします。 まとめさせていただきます。 自分が最も正攻法と考えているが手間がかかる方法�@： CAS9でKRASG12ないしは、G13に遺伝子変異をゲノム内に導入。1クローンを選抜したうえで、2個目の遺伝子変異もCAS9でゲノムに入れて、これもクローンを選抜する。あるいは、2個目はレンチウイルスで導入し、プラスミドの一過性ないしは恒常発現を期待する。 ショートカット法�A： 1つのプラスミドに2個の遺伝子変異を含めてレンチウイルスで導入し、過剰発現させる。 他にも派生した方法は考えられるのですが、目下上記を考えております。どなたかKRASモデルの細胞でご経験のある方はいらっしゃらないでしょうか。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---