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(無題) 削除/引用 No.9138-9 - 2020/09/10 (木) 01:13:57 - うっちー 有難うございます。 返信が遅くなり、すみません、ご指摘のように、floxあり/floxなしのヘテロ接合の意味で使用しておりました。混乱を招き、申し訳ありません。 頂いたアドバイスを元に、組み換え効率の確認を行っていこうと思います。 大変お世話になり、有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.9138-8 - 2020/09/07 (月) 09:54:45 - AA cKOが問題なく交配に使える場合には交配効率に都合から親に使うことは結構あるんじゃないかと思います。 f/f;Cre+とf/f;Cre-で交配すればすべてのマウスが実験に使用できます。 (Cre transgeneの挿入効果を無視することになるので指摘されることもあります) また、floxの表記は今でも混乱が生じることが多いように思います。 大抵は F=floxed (conditional KO allele) +=wildtype allele　(混乱を避けて"wild"を使う人も多いと思います) -=null (conventional KO allele) としていると思いますが、まれに+/-をloxP陽性/陰性の意味で使う人もいます。 質問者さんの"F/-"というのが"floxあり/floxなしのヘテロ接合"という意味なら表現型については納得できると思います。 floxed/nullのヘテロということであれば確かに表現型が出ないのはちょっと解せませんね。 Cre組み換え効率が良くないのであればCre;f/fマウスでは片側アリルでのみ組み換えが起こりf/-になっている細胞がそれなりに存在することになりますので。

(無題) 削除/引用 No.9138-7 - 2020/09/05 (土) 13:59:44 - mp cKOのマウスをさらに交配に用いているわけですね。 これって一般的なのでしょうか？ いずれにせよ、Cre+; F/Fで見えている表現形がCre+; F/-で見えないというのはちょっと解せないです。F/-の方が、組換えは片方のアレルだけ起こればいいのでより効率が良いはずなので。

(無題) 削除/引用 No.9138-6 - 2020/09/05 (土) 12:26:35 - うっちー M様 アドバイス有難うございます。参考文献まで添付いただき、有難うございます。本文献において行われている骨芽細胞の分離は、頭蓋骨（膜性骨）からの採取のようです。頭蓋骨からの骨芽細胞分離は確立されているのですが、現在私が表現型解析しているマウスでは、長管骨（軟骨性骨）のみに表現型を認めているため、この方法での解析が妥当かは不明です。頭蓋骨にも当該Creが発現していることは確認されているので、一度挑戦してみます。 mp様 アドバイス有難うございます。 私の理解力が乏しく、恐れ入りますが、ご指摘の意味が理解できません。現在の状況を説明させて頂きます。 使用しているマウスは、Cre+; Flox/Floxで劣成長となる表現型を認めており、Cre+; F/- の遺伝子型のマウスは、感覚的にはやや小さく感じますが、有意差は認めておりません。 そのため、解析にはCre+; F/F遺伝子型のマウスのみ使用しております。しかし、これをブリーダーとして用いると、身体が小さいためか、繁殖効率が非常に悪かったので、ブリーダーは、主に、♂Cre+; F/-と、♀Cre-; F/Fを交配しております。 恐れ入りますが、さらなるアドバイスがございましたら、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.9138-5 - 2020/09/05 (土) 10:20:43 - mp ちなみにcKOのゲノタイプはCre; F/F あるいはCre; F/-のどちらでしょうか？片方のアレルをnullにしておくことで、効率をあげられることがあります。もちろんF/-で表現系正常ということが前提です。

(無題) 削除/引用 No.9138-4 - 2020/09/05 (土) 10:13:33 - M 似たようなトピックを以前も見たような気がするのですが、骨芽細胞を分離する方法を確立しないと、一般的なアプローチ（ゲノムPCRでの組み換え確認など）で対応するのは困難と思われます。骨芽細胞が分離できないとなると、ノックアウト効率を見るには免疫染色かin situ hybridizaitonしかないように思いますが、これらの方法で定量的評価は難しいかもしれません。 骨のことはあまり知らないので、無責任かもしれないですが、例えば下の論文など見ると、骨芽細胞でのノックアウト効率をウエスタンで見てるようです。骨芽細胞の分離培養もできてるようなのですが、こんな感じでできないですかね？　骨芽細胞が分離できれば、ゲノムPCRでも、qRT-PCRでも、ウエスタンでも、評価可能と思います。 https://www.cell.com/cell/pdfExtended/S0092-8674(10)00621-5

(無題) 削除/引用 No.9138-3 - 2020/09/05 (土) 07:00:33 - うっちー 明確なアドバイス、有難うございます。 ひとまず、雌雄の両ブリーダーにCre+マウスを用いるのは保留にして、組み換え効率の確認を優先して行うことにいたします。 骨芽細胞をターゲットとしたCreを使用しています。 そのため、目的遺伝子を骨芽細胞特異的にノックアウトすると、明らかな劣成長（大腿骨長が野生型の6割程度の長さ）を認めます。しかし、同腹仔の同遺伝子型のマウスのうちの約半数が、野生型と同じ長さの大腿骨となっておいるため、どうもCreがうまく作用していないのではないかと考えております。 ノックアウトの効率を調べる目的で、ターゲット遺伝子Aの大腿骨におけるmRNA発現をリアルタイムPCRで調べようとしました。しかしながら、大腿骨には、軟骨細胞などの他の細胞においても目的遺伝子が発現しているため、それにマスクされたのか、有意な差は認められませんでした。genomeをPCRで調べる方法は行っておりませんが、同じ理由で、確認が困難かと考えております。 近日中に、免疫染色にて、目的タンパクと、骨芽細胞の共染色を行い、骨芽細胞における目的遺伝子のノックアウトがうまくいっているか、確認する予定をしています。しかし、自身では未確認ですが、他の研究者からの情報によると、骨組織での私の目的遺伝子の染色は、良い抗体がなく、あまりうまくいかないことが多いようです。 Creの発現量や、組み換え効率を調べるための、良い方法が他にあれば、御教示頂けますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9138-2 - 2020/09/04 (金) 12:47:54 - AA >>Creの発現量が低いために、組換え効率が悪くなっている と仮定されているなら、その対応策を取る前に本当に組み換え効率が同腹仔の間で異なっているのか確認されたほうがよろしいかと思います。 どの組織かわかりませんが、Creを発現している組織をとってきて、genomeをPCRなりで確認してみたときに切れていたりなかったりするんでしょうか？ もしすべてきれいに組み変わっていればいましている検討は無意味です。 片親のみがCre遺伝子を持っていて、同腹仔で切断効率に差があるのであれば、 Cre/+のヘテロ接合同士で発現量に差があることになるのでホモ接合にしても変わらない気がします。 むしろ万が一、ゲノムインプリンティングのようなことがあれば父由来Cre/+と母由来Cre/+で差が出てしまうのでより一層わからなくなりそうです。 表現型をなにで見ているのかにもよりますが、”ばらついている”のが遺伝子発現そのものなのかどうか、先に確認されることを強くおすすめします。 (例えばマウスの行動解析などであればそのばらつきは遺伝子型関係なく大きいです)

Cre/loxPシステムの交配方法について 削除/引用 No.9138-1 - 2020/09/04 (金) 06:59:02 - うっちー Cre/loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウトマウスの作製を行っています。同じ遺伝型の同腹仔においても、表現型のバラつきが大きく、Creの発現量が低いために、組換え効率が悪くなっているのではないかと推測しています。 これまでは、ブリーダーのうち、雄または雌のどちらか一方だけ、Cre+のマウスを用いてきました。Creの発現量を上げるための方法として、雌雄両方ともCre+のマウスを用いて交配してみようかと考えているのですが、効果はありますでしょうか。 また、雌雄両方のブリーダーにCre+マウスを用いた場合の問題点などがございましたら、御教示頂けますでしょうか。 また、Creの発現量を計測する方法がもしあれば、併せて教えて頂けますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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