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(無題) 削除/引用 No.9145-8 - 2020/09/07 (月) 20:10:36 - G25 泳動バッファーに塩酸が入ると、ゲル内へ無限に塩化物イオンが供給され、常にタンパク質を追い越していくので、タンパク質の移動度が下がるんだと思う。

(無題) 削除/引用 No.9145-7 - 2020/09/07 (月) 18:08:28 - AA 溶液から逆算して必要なぶんだけTris入れるの結構しんどそうに思いますがどうなんでしょう。 私自身は粉から溶かして作っていますが、下記のアブカムの情報のように、pH調整を行う旨を記載しているプロトコルもあるにはあるようです。 ttps://www.abcam.co.jp/protocols/western-blotting-protocol "必要に応じて pH 8.3 に合わせる。"とあるので「必要に応じて」の部分がみそなのかもしれませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.9145-6 - 2020/09/07 (月) 17:45:19 - xcvghj ラボプロトコルに書いてあるからとか、先生や先輩に教えてもらったことでも、ちょっとでも変だなと感じたら（てか感じなくても）複数の（→ここ大事。たまに間違ってるのあるから）書籍やweb情報でちゃんと自分で確認してたほうがいいです。誤りのあるプロトコルが代々受け継がれているケースが実際あるし、シニアの研究者でも基本的なことを間違って理解してる人は少なからずいます。

(無題) 削除/引用 No.9145-5 - 2020/09/07 (月) 17:30:39 - おお http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec10475.full 10X Running buffer Dissolve 30.0 g of Tris base, 144.0 g of glycine, and 10.0 g of SDS in 1000 ml of H2O. The pH of the buffer should be 8.3 and ***no pH adjustment is required.*** Store the running buffer at room temperature and dilute to 1X before use. 質問ややり取り見てもどうやってバッファー作ったのか、どのように改善しようとしているのかわからん。 上記のようにTris (base)の粉とグリシンの粉とSDSを混ぜるだけ。 泳動の挙動から明らかにおかしい（おそらくバッファーが）。 あとね、電流の説明は不十分だよ。ゲルの厚さが変わると変わるから。 もしかして２M Tris-HCl （pH８.３）から３gに相当する量を加えている？

(無題) 削除/引用 No.9145-4 - 2020/09/07 (月) 17:13:45 - G25 いや、一般的なレシピではないですぞ。 トリスは2M pH 8.3に調整した溶液を使用なんてありますが、 Laemmli running bufferではHClによるpH調製は禁忌のはず。電離度の高い塩酸が入ることでイオン強度が高くなるし、タンパク質の荷電もおかしなことになる可能性があります。 Tris base 25 mM Glycine 250 mM SDS 0.1% になるように粉末を純粋に溶かすだけ（プラクティカルには10xで作って要時希釈だけど）。確認のためpHを測って8.3かその前後になっていなければ、なにか間違いがあったということ（試薬の取り違え、計量ミス、試薬の品質など）で最初から作り直し。間違えても塩酸などでpHしてはいけない。 あなたのとこのレシピは塩酸でpHを下げている分、グリシンの濃度を下げているようだけれど、ほんとうにそれで大丈夫なのだろうか？ （どこかにソースがあるのかな？）

(無題) 削除/引用 No.9145-3 - 2020/09/07 (月) 15:06:57 - buffer ありがとうございます。 ２M tris-HClは他の用途にも使うため様々なpHで保存しておりますが、そのうちpH 8.3のものを泳動バッファーとして使用するよう上の先生から教わっておりました。 あまり考えたことがなかったですが、おっしゃるとおりHClが抵抗が大きくなる要因かもしれませんのでさっそく作成して試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9145-2 - 2020/09/07 (月) 14:40:02 - xcvghj 2M Tris-HCl pH8.3とTris 0.3 gのところがどういうふうなことをしてるのかがよくわかりません。 質問に書かれている重量を1はかり1Lの水に溶かすだけです。pHは確認も調整もしません。（ていうかこの量比でGlycineとTrisを混ぜれば所定のpHになるので不要でHClのもちこみはむしろ避けるべきなのでpH調整はしないようにと聞いています。ジュール熱の発生が普通よりも大きいのはそれも関係してるような気もします）市販ゲルで泳動時間が早いものはゲル組成に非公開の工夫があるのだと思います。

SDS-PAGEの泳動バッファー 削除/引用 No.9145-1 - 2020/09/07 (月) 13:57:55 - buffer いつも参考にさせていただいております。 過去に討論されている議題であれば恐縮ですが、タイトルの通りSDS-PAGEに使用する泳動バッファーについてです。 わたしたちの研究室ではおそらく一般的に用いられている下記の組成のものを使用しております。（トリスは2M pH 8.3に調整した溶液を使用） トリス ...........3.0g グリシン .........14.4g SDS ............1.0g 実際に泳動してみるとmini gel２枚だと。低電圧で200Vだと開始時は90mA程度が３０分後くらいには60mA程度になって、結局終了まで２時間程度と結構時間がかかります。 定電流で100mA程度にすると多少早く終わりはしますがかなり熱があがり、バンドが歪むことが多いです。 さらにゲルサイズが大きくなるとますます時間がかかってしまいます。 泳動中に抵抗があがっていくことは仕方のないことかと思いますが、ネットを見てますと泳動が30分以内で、とか商品によっては10分で、などの記載も目にします。 自作のbufferで泳動を早く終了させるコツ、組成などご存じの方はいらっしゃいますか？ よろしくお願いします。

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