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(無題) 削除/引用 No.9148-14 - 2020/09/15 (火) 11:31:20 - taro >[Re:13] 謎の男さんは書きました : > もし標的遺伝子を蛍光で標識したいだけならSafe harbor部位にpromoter+GFPなどを入れるのはいかがでしょうか。 > マウスやヒトならSafe harbor部位を編集した論文はたくさんありますし、AddgeneのもworkするCRISPRやTALENがあり、活性チェックもしなくてよいと思います。 > > あとCRISPRでノックインするとヘテロノックインの場合はノックインしていないアリルはかなりの確率で非特異的な組み換えが起こってしまいますので、ご注意ください。 ありがとうございます。今回の目的では標的遺伝子を蛍光標識したいだけなので、教示いただいた方法も選択肢の一つとして考えられます。

(無題) 削除/引用 No.9148-13 - 2020/09/15 (火) 01:49:52 - 謎の男 当方、同様の実験をルーティンでやっています。 一度、質問者様と同じような実験をやり手ひどく失敗したので、一応書き込ませていただきます。 私もある遺伝子の下流に蛍光タンパク質及びbGhpAを入れ込みました、 蛍光タンパクは発現し、免疫染色でも完全に一致したのですが、遺伝子発現解析を行ったところその遺伝子の発現量が1000分の1程度まで落ちてしまっていました。 後々リサーチして分かったのですが、遺伝子を入れる際にLeft armとright armとして離してしまったた部分がmRNAの安定性にとりわけ重要だったみたいです。 もし標的遺伝子を蛍光で標識したいだけならSafe harbor部位にpromoter+GFPなどを入れるのはいかがでしょうか。 マウスやヒトならSafe harbor部位を編集した論文はたくさんありますし、AddgeneのもworkするCRISPRやTALENがあり、活性チェックもしなくてよいと思います。 あとCRISPRでノックインするとヘテロノックインの場合はノックインしていないアリルはかなりの確率で非特異的な組み換えが起こってしまいますので、ご注意ください。

(無題) 削除/引用 No.9148-12 - 2020/09/14 (月) 10:30:51 - AA ドナーが直鎖か環状かというのは過去にもトピックがあったような気がします。 基本的にはトランスフェクション効率には差があまりないというようなことだったかと思います。 組換効率を上げる方法としては、一本鎖DNAやMMEJを利用した方法など、ドナー側を工夫するのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.9148-11 - 2020/09/13 (日) 22:49:37 - taro そうなんですね。sgRNAの標的配列を変えることも考えながら、もう少し検討してみます。 ちなみにドナーのDNAが直線状か環状かで組み替え効率が変わったりすることはあり得ますでしょうか？Thermoのlipofectamine CRISPRMAX の導入効率を示した論文では何故かドナーとしてわざわざ直線状のDNAを用いてありました。 Cas9を遺伝子として、入れる場合、DNAse分解を避けるため、発現の効率を考えて環状プラスミドの方がいいと思うのですが、ドナーの場合、制限酵素などで直線化などした方がいいなどがあったりするのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9148-10 - 2020/09/13 (日) 20:24:29 - AA 無細胞系でのチェックであれば7割は切断効率は高くありません。 8割かできれば9割以上ほしいところです。 あとは細胞でのノックイン効率は決して高くありません。 プラスミドでCas9を入れる場合なんかだとpuroでの選択圧をかけたりしてますが、 RNPで入れるときはそのあたりが難しいですね。 根気よくやるしかないのかもしれません

(無題) 削除/引用 No.9148-9 - 2020/09/12 (土) 19:32:24 - taro 昨日早速、標的配列の切断効率を確認し、7割程度切断できていました。ありがとうございました。sgRNAとCas9はちゃんと機能してそうです。 マーカー 遺伝子が発現していることは免疫染色なので確認できていますので、 あとは組み替えはできているが、挿入しようとしているスプライシングバリアントだけが発現が極端に低いとか‥ あるいはやはりmCherryの発現をFCMでちゃんと捉えられていないか‥ この際なので、sgRNAの設計からやり直して、組み替え箇所を開始コドンの直後にして蛍光タンパク質遺伝子も分かりやすいeGFPなどにしてしまうことも考えています。

(無題) 削除/引用 No.9148-8 - 2020/09/10 (木) 11:52:13 - taro AA様 詳細なプロトコルをご教示いただいてありがとうございます。 早速、試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9148-7 - 2020/09/10 (木) 11:50:41 - taro NEBのCas9 Nucleaseのページを確認したら、無細胞でCas9を反応させる際のプロトコルが載っていました。 1X Cas9 Nuclease Reaction Bufferの組成が載っていましたが、これを見ると、一般的な制限酵素Bufferでいいようですね。 NEBのCas9はNEB3.1で37℃反応で、65℃失活と書いてありました。 ThermoのTrue Cut cas9 v2でも同じ条件でいいのか、分かりませんが、あまり大差はないかと思いますので、手元にあるNEBのバッファを使ってやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.9148-6 - 2020/09/10 (木) 11:44:42 - AA 反応液の組成は Cas9 proteinsが30 ng/ul sgRNAが25 ng/ul target PCR産物が10 ng/ul として、Cas9酵素添付のバッファーがあればそれを、なければNEBの3.1または3.0バッファーをいれて、バッファーが1xになる容量までnuclease free水でメスアップ、 です 37度で1時間反応させ、反応終了後にRNaseを加えて更に10分反応。 反応停止剤をかねて、反応液に直接ローディングダイ(SDS/EDTA含)を加えて泳動 という感じです。 各バンドの濃さを定量し、全バンドの合計値と、未消化バンド(最長のもの)と消化済バンド(低分子量に出るバンド)の値を比較して計算します。 よく切れるsgなら9割がた消化されます。

(無題) 削除/引用 No.9148-5 - 2020/09/09 (水) 21:55:47 - taro > Thermoからsgを購入されているようなので、sgRNAとCas9を細胞ゲノムからPCR増幅した標的配列と反応させて、制限酵素のRFLP解析のような感じで消化されるかどうかを見るとT7E1よりもはっきりした変化になってわかりやすいのでおすすめです。 > T7E1だと必要なアニーリングなどもいらないのですごく簡単です。 この方法はとても良さそうですね！ in vitoro無細胞系で酵素反応を生じさせる感じでしょうか？この方法であれば、毎回細胞を蒔いてトランスフェクションしなくても、標的DNAをPCRで増やして、冷凍保存しておけば、すぐに切断効率を調べられるということですね。 もしよろしければ、反応条件(標的DNAやsgRNA, CAS9の量、全体の計、バッファの組成、温度、反応時間など)をご教示いただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9148-4 - 2020/09/09 (水) 16:43:13 - AA T7E1アッセイが第一選択ではないかと思います。 ただ、T7E1はどうしても細胞への導入効率の影響を受けるので活性の評価がしづらいです。 私の体感ではフラグメントの3-4割程度がT7E1で消化されれば高効率です。 Thermoからsgを購入されているようなので、sgRNAとCas9を細胞ゲノムからPCR増幅した標的配列と反応させて、制限酵素のRFLP解析のような感じで消化されるかどうかを見るとT7E1よりもはっきりした変化になってわかりやすいのでおすすめです。 T7E1だと必要なアニーリングなどもいらないのですごく簡単です。

(無題) 削除/引用 No.9148-3 - 2020/09/09 (水) 13:36:49 - taro >[Re:2] asanさんは書きました : > > T7E1assayとかSurvayer assayとかPCRかけてTAクローニングして領域をいくつかシーケンスしてみるとか文献調べればいくらでも出てくると思いますよ。 ありがとうございます。やはりまずはT7E1assayの原理を使ったDetection kitからやってみるのが一番確実でしょうか。 実際に行ったことがないので、少々不安なのですが、 原理と流れとしては, sgRNAとCAS9をトランスフェクションした細胞サンプル溶解液と 標的配列を含む領域を増幅させるためのプライマー(Fwd, Rev)を自分で準備してPCR ↓ ミスマッチ検出酵素で、CAS9で切断・修復された箇所(ミスマッチ生成箇所)を見つけて切断 ↓ 電気泳動して、断片化の程度を確認 という流れで合っていますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9148-2 - 2020/09/09 (水) 13:01:50 - asan T7E1assayとかSurvayer assayとかPCRかけてTAクローニングして領域をいくつかシーケンスしてみるとか文献調べればいくらでも出てくると思いますよ。

CAS9のDSB効率の確認方法 削除/引用 No.9148-1 - 2020/09/09 (水) 09:40:57 - taro ThermoのsgRNAとTrueCut Cas9 Protein v2、lipofectamine CRISPRMAXを使って、細胞株ゲノムのマーカタンパク質遺伝子の下流(終止コドンの直前)に蛍光タンパク質遺伝子(mCherry)を挿入する実験を行っています。ドナーDNAは切断部位の前後のホモロジーアームで挟み込む形で蛍光タンパク質遺伝子を挿入したpUC19プラスミドを同時に投与しています。トランスフェクションして蛍光顕微鏡観察やFCM、蛍光プレートリーダーで確認しても、蛍光を発する細胞を全く特定できません。 うまくDSBが起こっていないのか？相同組み換えが起こっていないのか？それとも組換えは起こっているがそもそもマーカータンパク質の発現が低いのか？mCherryの蛍光が弱すぎて捉えられていないのか？原因を特定中です。 単純に考えて、いきなり本実験を始めてしまったのですが、なかなかうまくいかないので、ちゃんと段階を踏んで、一度Genomic Cleavage Detection Kitのようなキットを使って、切断効率を確認した方がいいのか？と考えています。 ただ、今回の場合ノックインなので、単純にトランスフェクションした後のサンプルのゲノムを精製して、切断部位を挟む形でPCRをかけるだけでも、うまく切断・挿入されているのかどうか分かるような気もします。でも、精製サンプルの中にドナーのベクターが混入した場合、それが引っかかってくるだけのような気もします。 今回のような実験の場合、どのようにしてゲノムのDSB効率を確認するのが良いでしょう。またCRISPR/CAS9が上手くいかない原因を特定するための方法として、どのような方法が考えられますでしょうか。ご教示よろしくお願いいたします。

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