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(無題) 削除/引用 No.9269-8 - 2020/10/31 (土) 08:48:28 - qPCR G25さん、AAさん、ありがとうございます！ duplicateで行うことにします。

(無題) 削除/引用 No.9269-7 - 2020/10/30 (金) 18:15:29 - AA 手技的にどんなに自信があったとしても、reviwerからみればどこの誰とも知らない人のデータなので、自信の根拠、すなわちもう1回やっても同じ結果が出ることを示せと言われると思います。 つまりは実験を2回しないといけなくなるのではじめからreplicateを置いて実験するほうが得策です。 ただ、G25様のコメントの通り、予備実験的に実施する場合には十分に自信があるならsingleでやったほうが、スループットも良くなりますしコストも抑えられるので良いと思います。 ケースバイケースですね

(無題) 削除/引用 No.9269-6 - 2020/10/30 (金) 15:58:02 - G25 いわゆるtechnical replicateというやつですね。 >これまでに複数回qPCRを施行し、特にそこまで大きくずれる経験はありませんでした。 ただの幸運だったのかも。 triplicateして一個だけ大外れ値になるってこともありますよ。 そういうときは3者で多数決してハズレ値は捨てるということができます。duplicateだと値に齟齬があった場合、疑いのある値に目をつけることはできますが、どっちが本当らしいかの判断がむずかしい。 replicateなしだと、それがたまたま外れ値だったときに怖い。 いかにトレーニングを積もうと、絶対にエラーがないとは言い切れないし、たまたま装置やプレートの不具合にあたって変な値がでてしまうかもしれない。 そういうリスクを念頭にした上で、replicateをとらないでやることはあります。スループット重視で、ざっと傾向をサーベイするための予備実験的に。でも、ほんちゃんのデータとりではやらないな。

(無題) 削除/引用 No.9269-5 - 2020/10/30 (金) 07:09:33 - qPCR RNA様 コメントをお寄せくださり、ありがとうございます。 なるほど、確かに納得しました。 384ウェルは未体験ですが、そのくらいの確率で出てしまうものなのですね。 ありがとうございます。やはり、duplicateで行うこととします。 お聞きして本当に良かったです。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9269-4 - 2020/10/30 (金) 04:24:17 - RNA 私はduplicateでやっています。 dupliが必要かと言われるとsingleでも十分だと言えるほどにトレーニングは積んだつもりです。 しかし、それでも384wellで数回測定すると１点くらいはoutlierが生まれてしまいます。 １）その際に、outlierなのか本当の値なのかを考える手間や無駄な心配をduplicateでしておけば省けます。 ２）また一般的にduplicate以上を求めれる世界で、sigleでデータにして論文にすることはあなたの手技を証明する必要も出てくることもあるのでしょう。 ということで私自身は1,2)を無駄に考える必要があるのであれば、機械的にduplicateでやってしまっています。

(無題) 削除/引用 No.9269-3 - 2020/10/30 (金) 03:59:24 - qPCR おお様、ありがとうございます。 in vivoのサンプルなのでやはりサンプル間の誤差は大きいです。 ただ質問はそこではなく、同一のサンプルを複数回qPCRをみなさんはしているのだろうかと思いトピックを立てました。 おお様がqPCRをする際にはどのようにされていますでしょうか？ 私の隣のラボの方は同一サンプルをtriplicateで測定しているようでした。 Ctで大きくずれても0.5ほどです。

(無題) 削除/引用 No.9269-2 - 2020/10/30 (金) 03:14:34 - おお どれだけブレるのか、ブレの許容範囲はどれくらいなのか。３回とかIndependentな実験をやるならそれでブレを吸収できる程度なのか。 それだけのことです。 DNAの濃度をUVなどで図るとき何回図りますか？

duplicateの必要性について 削除/引用 No.9269-1 - 2020/10/30 (金) 00:53:41 - qPCR お世話になります。 ご相談させていただきたいことがありまして、トピックを立てました。 よろしくお願いします。 当方、マウスの解析をしており、2つの臓器で遺伝子発現量を比較しようとしています。 マウスはWTとKOの3匹ずつで、cDNAは合計で12になります（2つの臓器、各3匹ずつのため）。 たとえばGAPDHを含めた4つの遺伝子を各臓器で比較する場合、 duplicateでPCRすると96ウェルを使ってしまうことになります。duplicateだと安心というのはもちろん同意していますが、これまでに複数回qPCRを施行し、特にそこまで大きくずれる経験はありませんでした。 duplicateをやめて、シングルウェルでのみPCRを行えば、各臓器につき8つの遺伝子を同じ96ウェルプレートで調べることができます。 みなさんはどうされているのか気になっておりまして質問させていただきました。 試薬の節約は経済的なこともあるのですが、COVID19の影響で試薬が届くまでに時間がこれまで以上にかかっていることなどがあります。 答えのないトピックだとは承知しております。 大変稚拙な内容で恐縮ですが、どうかみなさまのご意見を聞かせていただけますと幸いです。

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