全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9311-7 - 2020/11/17 (火) 05:20:10 - おお >[Re:5] Mさんは書きました : > 皆様ありがとうございます。 > > ベクターのバージョンはpET30a(+)になります。 > ポジコンとしてこのベクターを形質転換させた際には、37度、O/N培養でたくさんコロニーが得られました。ですのでコンピテントに問題はなさそうに思えます。 >ネガコン（ベクター3uLにMiliQを1uL加えたもの）のプレートも、コロニーが一つも生えませんでした。何がいけないのでしょうか…？ ネガコンで標準のプラスミドの量をくわえて全く生えないのはやはりコンピテントがあまり良くないと私は判断します。 >[Re:4] Nanasiさんは書きました : > ライゲーションミックスってligase とdNTPが最初から混ざってるやつですかね？ > 　 > それがヘタってると言う事はないですか？ dNTPではなくてATPだと思いますが、、、ただしわたしも念の為ATPを追加するようにしています。 違う制限酵素サイトは使えますか？

(無題) 削除/引用 No.9311-6 - 2020/11/16 (月) 22:59:17 - G25 pET30ならT7 promoter の系ですね。 その上で、老婆心ながら、 T7 proだからと言って、完全にleaky expression がないとは限らないので、その可能性も一応、頭に置いた方がいいでしょう。 T7 proだとBL21では大量発現を誘導することはできません。しっかりしたり意識を持たずにBL21(DE3)のことを、そう縮めて書いたんだと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.9311-5 - 2020/11/16 (月) 21:55:28 - M 皆様ありがとうございます。 ベクターのバージョンはpET30a(+)になります。 ポジコンとしてこのベクターを形質転換させた際には、37度、O/N培養でたくさんコロニーが得られました。ですのでコンピテントに問題はなさそうに思えます。 UV問題、インサートの量、ライゲーションミックスに関してはご指摘の通り、再度確認をし直してみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9311-4 - 2020/11/16 (月) 20:42:23 - Nanasi ライゲーションミックスってligase とdNTPが最初から混ざってるやつですかね？ 　 それがヘタってると言う事はないですか？ 試しにミックスでなくて普通にligase とdNTP でやってみるとか 少なくともポジコンを置くとかして見た方が早いかも

(無題) 削除/引用 No.9311-3 - 2020/11/16 (月) 20:05:37 - G25 ちがうベクターに乗せ替えるだけだからそんなに難しいことではないはずですね。 当たりが出ないどころか、コロニーが一つも生えないというのは、「ライゲーションがうまくいかない」のではなくて、原因は他にあるのでしょう。 UVは原因の可能性の一つに考えられます。 ところでpETのバージョンは？　BL21(DE3)ではなくて、本当にBL21ならlacプロモータで直接発現するバージョンかしら？　だとするとDH5alphanの中でleaky expressionがかなり高くなる可能性があります。発現ベクターにクローニングする場合、リーキーに発現する外因性タンパク質が宿主の増殖や生存を妨げるため、ちゃんとベクターに組み込まれたコンストラクトほど、生えてこないということが起こります。 そういう時の対処方は、 pETにもlacIqは乗っていますが、宿主もlacIqのものを選ぶ(JM109、XL1-blueなど)。 培養温度を30℃より低くして(室温〜18℃程度に)、外因性タンパク質の発現を緩める。 培地にグルコースを加えてlacプロモータの活性を下げる。

(無題) 削除/引用 No.9311-2 - 2020/11/16 (月) 19:34:55 - AA UVの当てすぎは過去のトピックでもよく指摘されています。 対処法もよく挙げられているのでそちらをご参考ください。 個人的にはライゲーション時はもっとインサートが大過剰でも良いような気はします。 他にはコンピテントセルのコンピテンシー低下も考えられます。環状プラスミドを形質転換したときはどの程度のコロニーが得られるでしょうか？ 効率が悪いときはコンピテントセルを作り直すと良いです。

ライゲーションが上手くいきません 削除/引用 No.9311-1 - 2020/11/16 (月) 15:33:16 - M お世話になります。 人工DNAをプラスミドの状態で納品してもらいました。3kbくらいのベクターに300bpほどの目的DNAが組み込まれています。2種類の制限酵素で処理し、目的のバンドを切り取ってキットで精製し、インサートとしました。トータル20uLでelutionし、そのうちの1uLを流し、マーカーの濃さと比較することで濃度を推定しました。 ベクターはpETベクターをインサートと同じ制限酵素で処理し、キットで精製しました。 インサート：ベクターのモル比が３：１になるように計算し、インサートを3uL, ベクターを1uL、TaKaRaのライゲーションミックスを4uL(プロトコルに準じています)混ぜたものを16℃で1時間ライゲーションしました。これをDH5αにトランスフォーメーションさせました。モル比を変えたり精製DNA濃度を上げたりと工夫はしてみたのですが、コロニーが一つも生えません。ネガコン（ベクター3uLにMiliQを1uL加えたもの）のプレートも、コロニーが一つも生えませんでした。何がいけないのでしょうか…？ ゲル抽出の際、ゲルを大きく切り取りすぎて余分なものが多かったこと、UVが当たる時間が長かったことは原因として考えています。 DH5αでプラスミドを増やした後、BL21を形質転換させてタンパク精製をすることが最終目的です。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---