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(無題) 削除/引用 No.9320-16 - 2020/11/25 (水) 12:23:55 - ど素人 NP様 研究人生山あり谷ありですが、お互いに頑張りましょう。 (^^)

(無題) 削除/引用 No.9320-15 - 2020/11/22 (日) 07:47:48 - NP ど素人様 おはようございます！ 全ての疑問に答えてくださり、ありがとうございました！ SSCは細胞内の複雑性と覚えていましたが、SSCに関しても結局は光を検出していたのですね...側方散乱光ということは知ってはいたのですが、きちんと頭で処理しないままここまで来てしまい恥ずかしいです。 暗く見るからSSCが大きくなるというのは本当にすっきり処理することができました。 実は最近Pacific Blue-CD45がなくなったので購入したのですが、BV421に次回から切り替えます... Hoechst33342の件でリンクを添付していただきありがとうございます！ 405付近では励起ピークの裾野のあたりだと思うのですが、これでも十分という理解なのですね！ 驚きでした。何も考えずhoeschstをこれまで使っていたことが恐ろしいです。 これまでとても丁寧にご解説いただき、本当にありがとうございました！ これからは一つ一つの使用する蛍光をフィルターに当てはめてデザインしていくことにします！ それをこれからすると思うだけでもわくわくが止まりません !! そして、私ももし質問をされた場合には人に優しく丁寧さを心がけようと決意しました！ ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.9320-14 - 2020/11/21 (土) 21:37:48 - ど素人 NP様 たまたま自分が専門で使ってる機器は少し知ってるだけですよ... FACS の原理を一番簡単に説明すると、自動化蛍光顕微鏡ということになります。 FACS は FSC (前方散乱光: 細胞の大きさ)、SSC (側方散乱光: 細胞内外の形状の複雑さ)、蛍光で細胞を数えます。 普通の顕微鏡でも細胞の大きさと明るさで、あとはカウンターがあれば目的の種類の細胞を数えられますよね。大きさはズバリ FSC のことです。明るい細胞と暗い細胞があるのは、光がまっすぐ透過すると明るく見え、乱反射すると目にとどく光が減るので暗くみえます。つまり暗くみえる=SSCが大きいということになります。 (実は顕微鏡のライトを消して、環境光だけで細胞をみると、生細胞より死細胞の方が明るくみえます。これは環境光が細胞に当たって乱反射すると目にとどくからで、それこそが SSCです。これは、黒い紙に鉛筆で線を引くと黒鉛の線が明るく光って見える現象と似ています。) FACS は顕微鏡なのですが、自動化しているため、人間がカウンターで数えるよりもの凄く速い速度(一万ヶ/秒以上)で計数できる、そういう機械となります。 > Alexa 750 と BV 786 はい。BV786 は比較的最近の蛍光標識です。もともと 405 レーザーでつかえるpacific blueという標識がありましたが、これがとても暗いため、Brilliant Violet (BV) 421 という標識が開発されました。これはとても明るい標識です。たしか、BV421をタンデム化して発光を遠赤外光に移動したものが BV786 であったと思います。 ただし、蛍光標識の吸光波長もある程度広いものがあります。したがい、PE-Cy7 と BV786 は別レーザーで励起する意図で使いますが、蛍光のもれこみが発生しますので補正が必要です。このような蛍光補正を cross beam compensation といいます。これと似てますが、 > hoechst33342 おっしゃる通りで、この標識は 405 レーザーでも使えるようです (自分は UV で使っています)。ただし、吸光の効率は 405 nm あたりでは低いですけど、十分使えるそうですよ。下のリンクの図をご覧ください。 https://static.bio-rad-antibodies.com/2016/cell-health/hoechst-33342-excitation-and-emission-spectra.jpg > BP おっしゃる内容で正解だと思います。 FACS は蛍光標識を選ぶコツを掴むことでぐっとデータの質を向上できますから、是非マスターなさっていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9320-13 - 2020/11/21 (土) 13:12:41 - NP ど素人様 コメントをいただきまして、重ねてお礼申し上げます。 とてもわかりやすくて、なるほどと何度も感じました！ > >735から750nmまでの光は検出されない に関して、す、すごいと思わされました。 私はFCMのすごいとことを何も理解していませんでした。 奥が深いんですね！ ごめんなさい、PerCPとPerCP-Cy5.5は自分の質問として相応しくなかったです、すみません... AlexaFluor750とBV786ではどうでしょうか？ この二つは蛍光波長が重なります。ただ、今調べてみるとAlexaFluor750に関しては640レーザーで励起されるのに対し、BV786は405レーザーで励起されるため、だから蛍光波長が似ていても別々のフィルター（といっても同一の780/60）で検出されるために同時に用いることができるということでしょうか？ あと、私はhoechst33342を使って核型解析をしていたことがあるのですが、fluorospectrum viewerを見るとなんとhoechst33342はUVレーザーで励起されるようで、私の使っているCelestaではそもそも励起されないはずでは？ならなぜ検出できたのだろう？と今思っています。多少なりとも405レーザーで励起されていたのでしょうか？ すみません、もう一つお尋ねさせてください！ ど素人様からLPとBPをご説明していただきましたが、Celestaの扉を開けるとLPと表示のあるフィルターはあっても、BPという表示のあるものはありませんでした。ひょっとして780/60というのが750から810までを検出するBPということなのでしょうか？ この週末を利用して、私がこれまでコンペンセーションでエラーが起きていた理由を一つ一つ解いて行きたいと思います！ほんと奥が深いですね！というか、私がこれまでマルチカラー解析を行っていたことがマグレというかたまたまの成功だったのだと思うと怖くなりました。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.9320-12 - 2020/11/21 (土) 10:39:52 - ど素人 NP 様 >735から750nmまでの光は検出されない その通りです。これは 774 様がリンクしてくださった spectrum viewer でみると分かりやすいですが、 735-750nm は PerCP-Cy5.5 と PE-Cy7 の蛍光がオーバーラップします。なのでここは検出しないほうが精度がよくなりますし、余計な蛍光補正が減ると思います。それでも PE-Cy7 の蛍光は十分明るく検出できることが多いです。 >PerCPとPerCP-Cy5.5 そうですね....FACSの場合、この2つは同じ検出器で検出する設定になっているのが一般的です。これらを別々の検出器で検出する設定になっているとすれば、かなりマニアックな設定だと思います。 もともと 20年–前は PerCP しかなかったのですが、これはとても暗い標識でした。そこで明るさを改善するために Cy5.5 とのタンデム標識が開発されました。タンデム標識では吸光波長は元のタンパクで決まり、そこから吸収したエネルギーが Cy なんとかに転送されて、Cy なんとかの特性で発光します。PE-Cy7 も PE が吸光して、Cy7 が発光します。しかもPE と Cy7 は発光波長が離れているので、PE と PE-Cy7 は別々に検出できます。 それとは異なり、PerCP-Cy5.5 は PerCP の改良版であり、PerCP と発光波長の近い Cy5.5 を敢えて選んでいるので、PerCP と併用することは想定されていません。もし併用されているとしたら、かなり特殊な事情があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9320-11 - 2020/11/21 (土) 09:16:13 - NP ど素人様 おはようございます！ 昨晩投稿を読みまして、そういうことだったのかと興奮がおさまりませんでした！ 羊土社さんのFCM入門本の原理の項も、ど素人様のコメントのお陰ですっと入ってきました。 全然質問と関係ありませんが、説明がほんとお上手ですね...それにもびっくりといいますか、感動しています。本当に、ありがとうございました。 735LPによって735nm以上の光が780/60のバンドパスフィルターに持ち込まれると750から810nmまでの波長がそこで検出されるとのことですが、735から750nmまでの光は検出されないということになってしまわないのでしょうか？ 早速ラボに来てセレスタの扉を開けて配置を眺めようとしたところ、すでに先輩が使用されていたので、終わり次第確認してみます！搭載レーザーはやはりど素人様のご指摘通り、488、405、640でした。 Fluoro spectrum viewerを眺めて一つ思うのは、例えば近接している蛍光波長を持つ2つの蛍光物質もFACE Celestaでは解析可能でした。たとえばPerCPとPerCP-Cy5.5です。この二つは(後者はタンデム蛍光ですが)ピークが重なっています。なぜこれを別々の蛍光として検出できるとのでしょうか？ 自力で理解したわけでは全然違うのですが、なるほどと思えたことがとても嬉しいです。 本当に親切に丁寧に教えてくださり、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.9320-10 - 2020/11/20 (金) 18:11:31 - ど素人 すみません、画像のリンクまちがったので訂正させてください。 https://www.bdbiosciences.com/assets/images/biosciences/facscanto_optics_sml.JPG あと eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 のリンクも忘れました... https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/65-0865-14#/65-0865-14

(無題) 削除/引用 No.9320-9 - 2020/11/20 (金) 18:09:47 - ど素人 NP 様 FACS は最初は誰でも難しいです。努力されているのは素晴らしいと思います。 フィルター交換はまあまあ高等テクに入りますね...多分 FACS Diva ソフトウェアで機器のセッティングを印刷できるので、それを見ながらやると分かりやすいと思います。たとえば: https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.bdbiosciences.com%2Fja-jp%2Finstruments%2Fclinical-instruments%2Fclinical-cell-analyzers%2Ffacscanto-ii&psig=AOvVaw3rtiNvMPMomv1VpnRmpmR3&ust=1605948954561000&source=images&cd=vfe&ved=0CAIQjRxqFwoTCNDG_prgkO0CFQAAAAAdAAAAABAb ローパス(LP)フィルターは、ある周波数より高い周波数をカットし、低い周波数の光のみ通します。(実際のフィルターには周波数ではなく波長が書かれているので、混同しないように) バンドパスフィルターは、指定された範囲の周波数の光のみ通します。 例えば PE-Cy7 の蛍光を観察するには、全波長光を735LPで処理します。すると735nm以下の光(周波数では高い)を反射して次の検出器に送る一方、735nm以上の光(周波数では低い)をそのまま透過させます。透過した先には780/60のバンドパスフィルターがあり、これは750〜810nmの光のみ透過させます。透過した光が検出器(センサー)に到達し、光の強さが測定されます。あとはこの繰り返しです。カメラに詳しい方ならフィルターのことも分かりやすいかもしれません。 あと、もし 640 nm のレーザー(赤)がついている場合は、以下の試薬を死細胞標識にすることもおすすめです。 eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 赤レーザーの 780nm は通常 APC-Cy7 という標識の蛍光を検出しますが、APC-Cy7は蛍光が暗いので抗原の標識としてあまり実用的でなく、死細胞標識に当てるとわりと合理的です。

(無題) 削除/引用 No.9320-8 - 2020/11/20 (金) 14:48:19 - 774 直接的な回答ではありませんし既にご存知かもしれませんが念のため。 組み合わせを考えるときにBDのサイトのSpectrum viewerが便利です。 https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/applications/research-applications/multicolor-flow-cytometry/product-selection-tools/spectrum-viewer

(無題) 削除/引用 No.9320-7 - 2020/11/20 (金) 14:13:56 - NP ど素人様 コメントいただき、ありがとうございます。 すっごく嬉しいです... すみません、405レーザーでした。 それを紫外線レーザーと混同してしまっていました。すみません。 はい、488と405は確かで、もう一つが561だと思っていましたが、ど素人様のコメントを読んで640かもしれないなと思っています。一度しっかり確認してみます。気付きを与えてくださり、ありがとうございます。 また、補正に関して非常にわかりやすい説明をいただき、とても感動しております。 先ほど別の組み合わせですが、マルチカラーを試しましたが、いい感じに解析できました。 PEとPIで、200％を超えるとエラーが出たことが多々ありました。 一度、PEの感度を下げ、PIの感度を上げてどうなるか、みてみようと思います。 私がもう一つどうにか学びたいなと思っているのは、フィルターの付け替えについてです。 ある蛍光を使う時にはこれとこれを付け替えて、ということが自分にはできません。 教えられたものに関してはできます。例えば、PE-Cy7を使う際にはデフォルトのこれを抜いて、代わりに引き出しにしまってあるこのフィルターを挿入する、というような感じで、理解して行っているとは言えないです。 ただ、マニュアルを見てもこういったことは書かれていないように思います。 もちろんLPフィルターだとかの意味や目的も全く現時点では理解していないので、これからですね！ 全くもって不勉強で浅はかな質問にも関わらず、本当にわかりやすく、丁寧にコメントをいただき、ありがとうございました。 おお様、 hoechst33342は持っていますが、これも3カラー以上のマルチカラーを行うといつもエラーが出ていました。ヘキストはマルチには使えない、という自分の根拠もなにもない結論を導くのではなく、まず原理から勉強したいと思います。 重ねてお礼申し上げます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9320-6 - 2020/11/20 (金) 12:49:44 - おお PIのかわりにHoechst 33258とかDAPIとかじゃだめですか。膜透過性が乏しいのでPIと同様細胞膜にダメージを受けた細胞を選択的に染めれます。

(無題) 削除/引用 No.9320-5 - 2020/11/20 (金) 10:45:35 - ど素人 488、561、UVというのはかなり変則的ですね。 BD のウェブサイトによると https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/instruments/research-instruments/research-cell-analyzers/facscelesta 488、405 がどの構成でも搭載されており、オプションで 640、355 (UV)、561とあります。このうち 640 (red) も必須として選択されることが一般的であろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.9320-4 - 2020/11/20 (金) 10:06:09 - NP ema様、詳しい方からのコメントをいただけてとても心強いです。 ありがとうございます。 私はあまりしっかり理解せず機器を操作していますが、他の方はマルチカラーで骨髄幹細胞を染めています。 ただ、PIや死細胞除去試薬は使っていませんでした。(CD45, CD48, CD150, lineage, cKitを同時染色) その方はきちんとしたデータを出されているので、機器の問題ではなさそうです。 また、機器自体も保証期間内ですので、定期的なメンテナンスはメーカーさんが行ってくださっています。 488、561とUVが搭載されています。 ”PIもしくはPEをそちらで振り分ける” この言葉にとても驚いています。 振り分けるというのは初めて耳にしましたが、具体的にどのように行うのでしょうか？ PIは1 ug/mlで染めています。Zombie YellowやZombie Aquaもあるのですが、それでもエラーが起きるようで（私自身が行ったわけではありません）、使っていません。 7-AADはよく耳にする試薬ですね。一度調べてみます。 本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9320-3 - 2020/11/20 (金) 10:04:40 - ど素人 こんにちは。エラーの内容をご紹介いただけると、多少はご助言ができるかもしれません。 FITC、PE、PIをお使いということですので、エラーとは別に、一般的に気を付けるべきことを書かせていただきます。まず、これらは FACS Celestaでは青レーザー(488 nm くらい)で励起されるのだと思います。重要なのは、それぞれの発光波長です。まずそれぞれのピーク発光波長はだいたい下記のようになります。 FITC : 530 nm PE : 575 nm PI : 617 nm 次に、それぞれの発光スペクトラムをご覧ください。 https://www.cytomad.com/blog/2017/10/8/the-virtue-of-viability https://images.squarespace-cdn.com/content/v1/59d0bff1cd39c3d497ea3ca1/1516857389288-3LKSFB41N7NSNF2S7EHL/ke17ZwdGBToddI8pDm48kF7TkaZiHVRAusVB55TM_fJZw-zPPgdn4jUwVcJE1ZvWQUxwkmyExglNqGp0IvTJZamWLI2zvYWH8K3-s_4yszcp2ryTI0HqTOaaUohrI8PIhkigAchMCAQW0azuW616ycQ-d4oNfopzqPHTPZmm2NE/spillover.png?format=1500w どういうことかといいますと、FITC と PE はわりとシャープな発光 (最大発光波長付近に限られた発光)をします。一方、PI はだらだらとした発光 (幅広い波長にわたる発光) をします。このため、PE の蛍光と PI の蛍光のオーバーラップが大きくなり、主に PI の発光が PE の検出器に漏れこみ (spill over) をおこします。 この spill over を補正することを一般に compensation といいますが、漏れこみが大きすぎると問題になります。とくに、蛍光補正値が 100 % 以上になってはいけません。たとえば PE - PI の補正値が 100 % 以上ということは、PE のチャネルが PI の蛍光に乗っ取られていることを示します。もちろん、100% 未満ならなんでもいいわけではなく、小さいほうがいいです。 因みに、PI の光の PE の検出器に入る漏れこみが大きすぎるとき、どう対処するかですが、(1) PE の検出器の感度 (voltage) を下げる (2) PI の検出器の感度 (voltage) を上げる のいずれかまたは両方となります。 ご参考になりましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9320-2 - 2020/11/20 (金) 09:45:03 - ema メーカー・機種は違いますが、この組み合わせは使いさらに多重染色をしています。 標準物質（ビーズ、キット）などではマルチで行い各カラー正常に出ているのでしょうか。 FACS Celestaの搭載レーザーはどこまででしょうか。通常はすべて488nmで行いますが、561nmが載っていたらPIもしくはPEをそちらで振り分けるという事を考えても良いと思います。 PIの濃度が濃すぎる、他の色素のものが非常に強すぎるということも無いのですね。 死細胞というなら488nmで使えるのでPIではなく7-AAD、Zombie Redを使ういう選択もあります。

PIとPEで蛍光補正にトラブルが起きます。 削除/引用 No.9320-1 - 2020/11/20 (金) 09:13:32 - NP はじめまして、私はフローサイトメトリーを利用して抗原解析をしているものです。 この度マウス組織を酵素でシングルセルとし、興味ある細胞での表面解析をすることになりました。 マウス組織からの細胞の調製ということで死細胞を除去する必要があります。 そこでPE, FITCに加え、PIを取り入れたところ、補正にエラーが生じてしまいました。機器はFACS Celestaです。 FITC, PE, PIはかなりよく使われるコンビネーションかと思うのですが、なぜエラーが出てしまうのでしょうか？PEがPIとトラブルを起こしているようです。 フローに関してはFITCとPE程度で3つの蛍光を扱うのは初めてです。 また死細胞除去をするのも初めてです。 機器もしっかり理解していると言われたらしていないです。2カラーで満足していたからです。このフローサイトメトリーを関しては現在技官さんもおらず、相談できる方が近くにおりません。大変稚拙な質問と存じますが、どうかコメントをいただけましたら幸いです。

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