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cAMP濃度測定 トピック削除
No.9605-TOPIC - 2021/04/08 (木) 07:16:09 - cAMP
AbnovaのcAMPキット(KA3388)を用いて「褐色脂肪組織」のcAMPを評価しました。

プロトコルに順じて、乳鉢での抽出を実施したのですが、褐色脂肪組織はソフトで脂状かつ小さな組織のため、紛失や乳鉢への付着が起こると採取不可となってしまいます。そのため、すり潰しすぎないように採取を行いました。なお乳鉢での抽出は素人です。

抽出に不安を覚えながらも濃度の測定を行ったのですが、50%程度の組織が検出感度以下の濃度となってしまいました。

乳鉢での抽出についてコツなどご存知の方、ご教授いただけないでしょうか？
なお、キットを変更したり、その他の抽出方法を試す予定はありません。あくまでこのキットで乳鉢あるいはそれに類似した方法で行います。
　
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No.9605-12 - 2021/04/14 (水) 08:24:18 - ゴン
私は100r以上の組織の場合は乳鉢ですりつぶして、一部を解析に、
残りを保存しています。

20-40r程度の組織であれば粉砕したときのロスがあるので、
チューブ、もしくは小さいサンプル用のガラスホモジナイザーでホモジナイズしています。
ラットの褐色脂肪細胞であれば乳鉢でよいと思いますが。

私はこのやり方で小さい組織でもcAMPやATPは問題なく測定できています。

(無題) 削除/引用
No.9605-11 - 2021/04/09 (金) 02:51:25 - おお
チューブの重さを測っておいて、すり潰したあとにチューブごと重さを測ればいいだけの話じゃない？

私が思いついたのはすりガラスになったホモゲナイザーだけど、、、

(無題) 削除/引用
No.9605-10 - 2021/04/08 (木) 22:39:05 - cAMP
粉末の重さは測れますか？

(無題) 削除/引用
No.9605-9 - 2021/04/08 (木) 16:34:06 - ななし
そのサイズであればG25さんが仰るように、
https://www.funakoshi.co.jp/contents/4777
上記のような直接すり潰せるチューブを使った方がロスが無いと思います。

(無題) 削除/引用
No.9605-8 - 2021/04/08 (木) 14:32:52 - cAMP
C57BLですね。潰す前は20-40mgといったところです。粉状での収量は5mg-20mgくらいになります。

(無題) 削除/引用
No.9605-7 - 2021/04/08 (木) 13:48:48 - ii
なんの動物種から取ってきた褐色脂肪組織なのか (どのくらいの大きさなのか) 分からないのでなんとも言えないが、マウス由来とかめちゃんこ小さい奴だった場合、乳鉢で定量的に取るってのは無理だろうなと思う。
クロロホルムか何かである程度脱脂したあとのペレットに界面活性剤で抽出したりできないかなとも考えたが、乳鉢以外やりたくないというならそれまでか。

(無題) 削除/引用
No.9605-6 - 2021/04/08 (木) 13:20:02 - cAMP
もちろん液体窒素で冷やしてやっております。
追記すると重さを測定して、Xmg/X00ulにする必要があるので、乳鉢に直接バッファーは難しいです。

どうもコツというコツはなさそうですね。

(無題) 削除/引用
No.9605-5 - 2021/04/08 (木) 12:54:37 - TS
ななしさんがおっしゃっているとおりですが、マニュアルにも液体窒素下で粉末状にすることになっているようですよ。

(無題) 削除/引用
No.9605-4 - 2021/04/08 (木) 10:37:31 - ななし
褐色脂肪ではありませんが私が小さいサンプルを破砕するときには、液体窒素でキンキンに冷やした乳鉢に少量の液体窒素を入れてその中でサンプルを破砕し（液体窒素が全部飛ぶまでゴリゴリし続ける）、薬さじでかき集めてチューブに回収するor乳鉢に直接bufferを加えて回収をしていました。
ご参考まで。

(無題) 削除/引用
No.9605-3 - 2021/04/08 (木) 09:53:10 - G25
どれくらいの大きさ、量の試料なんでしょうか。

直接、エッペンチューブやその他の試験管の中でホモジナイズするのがいいと思いますけど。
エッペンチューブ用のペッスル
あるいはペッスル付き10-mLくらいのディズポチューブ
なんかは普及品がありますし、
ポリトロン型のホモジナイザーなんかがあれば、ブレードのサイズによって50-mLチューブなんかまでいけますが。

(無題) 削除/引用
No.9605-2 - 2021/04/08 (木) 07:20:35 - cAMP
追伸；　他の抽出方法を試す予定はありませんがそもそも乳鉢での抽出は困難という意見がありましたら、ぜひコメントよろしくお願いいたします。その場合は素人なので、それ以上手を出さないようにします。

cAMP濃度測定 削除/引用
No.9605-1 - 2021/04/08 (木) 07:16:09 - cAMP
AbnovaのcAMPキット(KA3388)を用いて「褐色脂肪組織」のcAMPを評価しました。

プロトコルに順じて、乳鉢での抽出を実施したのですが、褐色脂肪組織はソフトで脂状かつ小さな組織のため、紛失や乳鉢への付着が起こると採取不可となってしまいます。そのため、すり潰しすぎないように採取を行いました。なお乳鉢での抽出は素人です。

抽出に不安を覚えながらも濃度の測定を行ったのですが、50%程度の組織が検出感度以下の濃度となってしまいました。

乳鉢での抽出についてコツなどご存知の方、ご教授いただけないでしょうか？
なお、キットを変更したり、その他の抽出方法を試す予定はありません。あくまでこのキットで乳鉢あるいはそれに類似した方法で行います。
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