BioTechnicalフォーラム [GeneArt Seamlessクローニングの使用感は？]

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No.1520-10 - 2013/03/19 (火) 10:27:29 - infusion

案様

＞４）クローニングしたいものによります。が、大体は15bpあれば余裕です。
　　　論文にもその記載があります。この手法のメリットは15bp程度の長さ
　　　で相同組換えがin vitroで出来てしまう所にあります

特にPPY株のようなものを樹立しなくても十分使えるということでしょうか？
論文ではずいぶんと差があるようなので。

Infusionをよく使って10kbp前後の一発クローニングをよくやるのですが、 SliCEがworkするなら予算的にずいぶん助かります。良い論文を紹介していただきました。

(無題)

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No.1520-9 - 2013/03/18 (月) 23:00:21 - yyy

案さん、
in vivoのRED組み換えの系（BAC recombineering等）だと、当然ながらプラスミドを切断せずにhomologous recombinationを起こさせますが、Sliceでも組み込む断片にselection markerとか入れてselectionをすれば、プラスミド切断する必要もないのですかね？
もしご存知でしたら教えて下さい。

遅くなりました。

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No.1520-8 - 2013/03/18 (月) 00:15:05 - 案

（１）VectorはpUC系およびpHY系(shuttle)でもworkします。
　　　homology領域のデザインだけしっかりと行なって下さい。
　　　菌株は、DH10Bを使用しています。巨大なプラスミドの
　　　導入効率が高いですが、growthはJM109より劣ります。

（２）エレクトロポレーションで実施しています。作者から頂いた
　　　プロトコールにも記載がありましたが、ケミカルコンピでも可能です。
　　　ただ、巨大なサイズの場合はエレクトロポレーションが良いとの事で　　　　す。10kb程度まで試しましたが、楽々クローニング出来ました。

（３）ATPはアデノシン-５’-三りん酸二ナトリウム水和物　08886-51
　　　ナカライテスクのものです。価格は2280円ですね。一度作ってし
　　　まうと、かなり大量に出来ます。ストックは-80度にでも入れて
　　　おけば、当面の間大丈夫でしょう。

（４）クローニングしたいものによります。が、大体は15bpあれば余裕です。
　　　論文にもその記載があります。この手法のメリットは15bp程度の長さ
　　　で相同組換えがin vitroで出来てしまう所にあります。

>>大腸菌の粗抽出液由来の阻害物、例えばDNaseとか、本当に問題ないのでしょうか？

恐らく大量に存在するでしょう。しかし、SLiCEは本当に効率が高い手法で、
in vivoでのRED組換え系よりもはるかに高効率です。影響は無視出来ます。
37℃で1時間反応させますが、全く影響が気になった事はありません。

★注意する点★
培養する時、恐らくエアレーションの問題でしょうが、ODが論文記載値まで
上がりません。OD5.5程度が限界なので約2倍量のペレットを使用しています。
Cellytic Bは、メーカープロトコールよりもかなり少ないです。完全には
溶解しません。そのまま続行しても問題ないです。記載にはないので注意
して下さい。また何か質問あれば、分かる範囲でお答えします。

(無題)

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No.1520-7 - 2013/03/12 (火) 10:01:45 - ころ

SLiceを紹介した人の回答が無いですね。

大腸菌の粗抽出液と、切断したプラスミドと、インサートを混ぜると、環状のプラスミドができますというのは、素朴で面白い方法です。

ですけど、大腸菌の粗抽出液由来の阻害物、例えばDNaseとか、本当に問題ないのでしょうか？

(無題)

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No.1520-6 - 2013/03/09 (土) 08:46:32 - びん

案様

Sliceというのは初めて知りました。キットを使わずに、自分で色々と組み立てられるという点が当方好みです。ただ次の３点の御経験を教えてください。

（１）当方ではpUC19とJM109の組み合わせで、実験を申請して許可を得た直後なので、できればこの組み合わせで実施したいです。御紹介の論文で記載のプラスミド以外でもうまくワークしているでしょうか？

（２）御紹介の論文では、主にエレクトロポレーションで大腸菌へトランスフォーメーションしています。案さんもエレクトロポレーションだけで実施されているのでしょうか？エレクトロポレーションの機械が無いので、その点が心配です。

（３）御紹介の論文から考えられる試薬のほとんどは手元にありますが、セルリティック™ B細胞溶解液（Sigma B7435-50ML　7700円）とATPを購入する必要があります。論文ででは、ATPとだけ記載されています。どのぐらいのグレードのものを購入する必要があるでしょうか？アデノシン 5'-三りん酸二ナトリウム, 結晶（1g　和光 303-50511 800円）程度の値段でも良いなら良いのですが、分子生物学グレードのものとかになると、キャンペーン価格のリガーゼなどよりも高くなってしまいます。

（４）論文の表１を見ると、インサートをPCR増幅する際に、ベクターと相補の配列を５’末と３’末のそれぞれに30bpとか42bpとか追加したプライマーを用いる必要がありそうです。かなり長いなという印象です。案さんは、どのくらいのbpを追懐したプライマーをお使いでしょうか？

（５）他に注意点などは無いでしょうか？　

(無題)

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No.1520-5 - 2013/03/08 (金) 23:49:46 - 案

SLiCEはご存知ですか？
もしご存知なければ論文読んでみて下さい。
うちでは、in Fusion等よりもはるかに高い効率(ポジティブクローン率も)
でクローニングができてます。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22241772

(無題)

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No.1520-4 - 2013/03/07 (木) 20:17:44 - びん

ごん様

両方を使っている方の貴重な御意見をさっそくいただけて、非常にありがたいです。

No.1485-8で、Infusion法についてmonさんの書かれた様な事はGENEARTでもありそうでしょうか？

特に、同じコロニー数を得るにはDNA(vector,insertともに）は通常のligation法に比べ多く必要で、insertはfreshなものが良く、制限酵素で切ったvector DNAはゲル精製が必須でしょうか？稀に接続部分が1bp欠けた御経験はあったでしょうか？

御存知の範囲で、よろしくお願いし増す。

(無題)

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No.1520-3 - 2013/03/07 (木) 10:59:52 - ごん

In-Fusion, GENEARTともによく使用します．

原理は同じだと聞いたことがあります．

使用感については対して差はないと思いますが，
若干GENEARTの方がポジティブクローン取得効率が高いような気がします．
ですが，単に反応のvolumeの差による
ハンドリング性の違いの影響なのかもしれません．

キャンペーンの時期と試薬の枯渇のタイミングにより
買い分けています．

反応はマニュアル記載の半量でもなんら問題ありません．

(無題)

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No.1520-2 - 2013/03/06 (水) 21:15:04 - びん

変な所で改行が入りすみません。なぜか削除、再投稿ができないので、読みにくいですが、そのままにさせていただきます。

GeneArt Seamlessクローニングの使用感は？

削除/引用

No.1520-1 - 2013/03/06 (水) 21:12:42 - びん

皆様には多くの御助言や情報をいただき感謝しております。

また教えてください。

In fusionクローニングに似たような原理（？）の、GeneArt Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix というのがありますが

、もしお使いの方がいらっしゃれば使用感を教えてください。

別トピック（1485）で話のあった、In fusionクローニングのメリットデメリットは、GeneArtR Seamless Cloning and Assembly

Enzyme Mix でも同様でしょうか？

それとも後発なので、問題点が少ないのでしょうか？

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