全69件 ( 21 〜 40 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. 3. 4. /4

増えます）すいません。今時間がないので、取り急ぎこれだけ 削除/引用 No.180-50 - 2012/02/23 (木) 15:03:31 - PCR Ex4-Ex6プライマーで増えたPCR産物をテンプレートとして、Ex4-Ex5'プライマーでPCRをかけた場合、きちんと目的サイズのバンドが得られます。PCR産物にEx5'が含まれているか確認するという意味でやったわけではなかった（私はそこを全く疑っていなかったので）のですが、既に試しております。 最初のシークエンスはPCR産物に対して直接行っています。abさんの推測の通り、ゲノム配列と照らし合わせて、どうやらalternative Ex5'で、新規スプライシングバリアントのようだ、となりました。そこで、1)G'特異的プライマーを作って、組織ごとの発現量を調べよう　2)どのみち将来のことを考えれば、発現ベクターがあった方が便利だから作ろう　と考えました。発現ベクターを作成中の間に、上記のシークエンスを読むのに使ったPCR産物をテンプレートにしてEx4-Ex5'プライマーでPCRをかけ、バンドが出ることは確かめました。このPCRをやった私の意図は、単純にプライマーがワークするかどうかチェックしようというものでしたが。特に問題が起こらなかったので、発現ベクターがトータル一週間で出来上がり、その後のPCRの条件検討にはプラスミドを使いました。発現ベクターのコロニーは6個拾って全部をシークエンスにかけましたが、どれも最初に読んだときの配列と基本的に同じです（最初のシークエンスにかけたPCR産物では、安いTaqを使って増やしたことに由来する（と思われる）ゲノム配列との塩基配列の違いが何塩基かでみられましたが、発現ベクター作成用にはhigh fidelityのTaqを使ったので、このような違いは見られず、6個のクローン全てが完全にゲノム配列データベース上の塩基配列と一致しました）。 SNPsについては正直考えていませんでした（なので、こういう提案をして頂けると大変参考になりありがたいです）。上記6クローンのシークエンスのピークを再度チェックしましたが、二重のピークは（特にプライマーを設計した部分をチェックしましたが）特に見あたらないようです。

(無題) 削除/引用 No.180-49 - 2012/02/23 (木) 06:06:30 - ab プライマーの認識能の問題な気がします。 cDNAからのPCRの場合、アンチセンスプライマーのアニーリング効率が悪ければ、いくらセンスプライマーがよくても増えません。 プラスミドやPCR産物は二本鎖なので、アンチセンスのアニーリング効率が悪くても2xcycle数でセンス鎖を増やす事ができます。サイクルが増えれば、その分センス鎖が増えてくるので（理論値10サイクルで20倍）、効率の悪いアンチセンスプライマーも多少はアニーリングして増幅することは可能ではないでしょうか。 あくまで憶測ですけど。 プライマー設計の失敗の頻度は、PCRやシークエンスの変異導入の頻度より高いので、2種類のプライマーを設計してどちらも増幅できなかったとしても、そんなに驚く事ではありません。 たぶん、ゲノムDNAの情報も確認して、alternative splicingだとしているのだと思いますが、ゲノムDNAと配列が異なるなら、シークエンスやクローニングの問題かもしれません。 今回の場合、exon 6に対するアンチセンスプライマーで増幅できているので、exon 5'に対するセンスプライマーを設計しなおしてはどうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.180-48 - 2012/02/23 (木) 01:19:46 - nnn cDNAを用いて、Exon4とExon6のプライマーで増幅したPCR産物を、 ゲルから切り出して精製した後、クローニングはしないで、 Exon4のプライマー、Exon6のプライマーで、ダイレクトシークエンスを行うのが 遺伝子解析の定法手段だと思うのですが・・・。 SNPsがあるならば、ピークが２重に出てきます。 私でしたら、プライマーの再設計を行います。 Exon4-Exon5' Exon5'-Exon6 の組み合わせが考えられると思うのですが。 場合によっては、今あるExon4とExon6のプライマーを使わず、 Exon4（もしくはExon6）のプライマーも再設計して、 最適なプライマーペアにすると思います。

(無題) 削除/引用 No.180-47 - 2012/02/23 (木) 00:48:52 - やま >リニアにしてからやった方がよい理由というのは PCRさんが書いた通りです。少しでも条件を近づけた方が良いと思うからです。 ちょっと話が混乱中ですがNo.180-27をまとめると cDNAをEx4-Ex6プライマーでPCRしたPCR産物（の希釈物）からEx4-Ex5'プライマーで増幅不能 plasmidをEx4-Ex6プライマーでPCRしたPCR産物からはEx4-Ex5'プライマーで増幅可能 ということですよね？ やはり、皆さんが書かれているようにcDNAからのEx4-Ex6産物の大部分が本当にEx4-Ex5'-Ex6かということがかなり疑われる結果だと思います。 plasmidにクローニングしたときには何クローン拾ってシークエンスしましたか？ 全て同じでしたか？この辺の情報があると良いんですが。 クローニングしやすいものとしにくい物もあるので一概には言えませんが。 簡単に調べる方法としては、cDNAを4-6でPCRしたPCR産物を Ex5は切れずに　Ex5'は切れる制限酵素（Ex5'プライマー上にあるとベスト） でカットしてみて、全部切れるかどうか見てみると良いかもしれませんね。 plasmidをEx4-Ex6のプライマーで増やした物がポジコンになりますし。

(無題) 削除/引用 No.180-46 - 2012/02/22 (水) 23:49:49 - う toyo様の書き込まれた内容は、すでに私が書き込んで すでにPCR様に頭ごなしに「言っている意味がわからない」と 否定されたことです。 多分、よく焦点がわからない質問で、 以前の私同様勘違いをなされているのでしょう。 他の人も混乱させると思うので、AP様の秀逸なまとめを引用します。 >・RT-PCRでexon4-exon5'間の増幅が認められない。しかし、exon4-exon6ではexon5'を含む想定の産物が得られる。これに合理的な説明がつくだろうか。 ここが問題なのです。

(無題) 削除/引用 No.180-45 - 2012/02/22 (水) 22:25:39 - toyo 横から失礼します。DNAワークからは遠ざかっているのですが、山勘で仮説だけ思いついたので投稿してみました。 プラスミドではexon4-exon5'のプライマーで増幅がかかる、ということだったと思いますが、皆さんがご指摘されている通り、プラスミドはcDNAと比べて大量のテンプレートを含んでいると仮定します。 つまり、cDNAからのPCRには、プラスミドと比べて余計にサイクル数が必要になるとおもいます。 一方、exon4-exon5'のプライマーセットでは、(ヘテロ・ホモ・セルフ等)ダイマー形成が起き3'末端側に数塩基伸長するなどして、本来のターゲットを伸長できなくなると仮定します。 この場合、薄い濃度のサンプルを増幅させようとしてサイクル数を増やすと、正常なプライマーの数が徐々に減っていくでしょう。 その結果、大量のプライマーが必要とされる後半の方のサイクルにおいて正常なプライマーが不足し、薄い濃度のサンプルが理論通りに(2のn乗で)増幅されなくなる可能性があるのではないでしょうか? 異常なプライマーと正常なプライマーがターゲットに対する結合の際に競合して増幅効率が余計に下がりそうですし、プライマーダイマーが電気泳動+EtBrでは検出できない可能性もありそうです。 もしこの仮説のようなことが起きているとしたら、cDNA中に想定されるターゲットの濃度程度までプラスミドを系列希釈してリアルタイムPCRにかければ、増幅効率が一定でなくなるのではないでしょうか。 既にお持ちのexon4-6のPCRの結果から、cDNA中のターゲット濃度にあわせてプラスミドを希釈することは可能かと思います。 この場合、最終的にはプライマーの再設計を検討することになりそうですので、問題の原因追及に時間を費やすよりは、予算が許すならいきなり再設計を検討してもよいかもしれません。 ただの妄想を長々と書いてしまいましたが、Rさん等もおっしゃっている通り、基本に忠実にプライマーの増幅効率や検量線を調べていればわかるような気もします。 皆様のコメントに付け加えるとすれば、できるだけ本番(cDNA)と同じ条件で予備実験を行ったほうがよいのではないかということです。

再設計 削除/引用 No.180-44 - 2012/02/22 (水) 21:41:36 - りん 私もRさんのEx5'プライマーの再設計に一票。 使用しているEx5'プライマーと相同性の高い配列が、用いているcDNA中に高発現してしまっているとかでは？

(無題) 削除/引用 No.180-43 - 2012/02/22 (水) 19:27:16 - R EX4-EX5'プライマーペアでの増幅効率が悪いのではないでしょうか。 EX5'に対するプライマーを設計し直してみてはどうでしょう。 プラスミドテンプレートでの増幅は、あまりポジコンとして考えない方がよいかもしれません。 圧倒的にPCRがかかりやすいので。 (納得してもらえないかもしれませんが) EX4-EX6の産物そのものをテンプレートにEX4-EX5'で増幅できるかを検証して成功したプライマーペアの方がcDNAテンプレートでも成功する可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.180-42 - 2012/02/22 (水) 19:19:22 - う よってたかっていじめるつもりは無いですが、 AP様の ＞このバンドは、以前シークエンスしたものと同じでexon 5'を含んでいるものだと信じているのですよね。 この部分に、信じているというか固執している気がしてなりません。 私も試した方がいいことは、同じですので、 PCR様の誤解が無いように丁寧にか書かせていただきます。 その４−５ダッシュー６を含んでいるはずのcDNAをテンプレイトにして ４−６プライマーセットで増えてくるバンド、 これをテンプレイトにして、さらに４−５ダッシュのプライマーセットで PCRする そうすれば、嫌いな私のガタガタ抜かしたことを 一蹴することができるかもです。

(無題) 削除/引用 No.180-41 - 2012/02/22 (水) 18:41:52 - AP >結果は、プラスミドを加えたサンプルと加えなかったサンプルでそれぞれ同じような太さのバンドが見られました（Real time PCRでは無いため、はっきりどれ位違うとはいえませんが、見た目違いなしです）。 「プラスドを」ではなく、「cDNAを」でしょうか？ >上記のcDNAとは別の組織から作った、G'をそれなりに発現しているcDNAを5倍希釈して、Ex4-Ex6プライマーでPCRをかけ、faintとまではいかないものの細いバンド（100bp大きいもの）を得られました このバンドは、以前シークエンスしたものと同じでexon 5'を含んでいるものだと信じているのですよね。たまたまサイズが一致しているけれど違っている（artifact）のかも。このPCR産物を鋳型にexon 4-5'でPCRかけてみてはどうでしょう。想定通りなら増幅するはずですよね。これで増えてくるようなら、この路線でもうすこし攻めてみてもいいけれど、増えてこないなら何かおかしい、前提になにか思い違いや事実誤認があるのではないかと疑います。 （増えない方に3000ギルド）

(無題) 削除/引用 No.180-40 - 2012/02/22 (水) 18:39:07 - KY >[Re:39] Qさんは書きました : > なるほど、APさんの書き込みから理解できました。 > KYさんもExon4-6で増えるということ念頭において書き込みされた方がいいと思います。（これから書き込まれる他の方々も）KYさんのようにPCRさんが焦点を絞るべきポイントが伝わっていない方が現れて書き込みするとまた話がそれる気がしますので。 すいません。みなさんのご意見をあまり理解せずに投稿しました。 すでにEX4-EX6を増幅するプライマーセットとEX4-EX5'を増幅するプライマーセットは増幅効率が同じくらいであり、同じぐらい低感度のテンプレートでも検出できることが確かめられていたということしたか。

(無題) 削除/引用 No.180-39 - 2012/02/22 (水) 18:20:35 - Q なるほど、APさんの書き込みから理解できました。 KYさんもExon4-6で増えるということ念頭において書き込みされた方がいいと思います。（これから書き込まれる他の方々も）KYさんのようにPCRさんが焦点を絞るべきポイントが伝わっていない方が現れて書き込みするとまた話がそれる気がしますので。

(無題) 削除/引用 No.180-38 - 2012/02/22 (水) 18:09:44 - KY >この5倍希釈cDNA0.5ulに、0pg、5pg、50pg、500pgのプラスミド（それぞれ1ul、希釈には水を使いました） 5pgのプラスミドというのは約10000コピー以上のプラスミドなので、cDNAに比べたらそれなりの量だと思います。 もしそのcDNA溶液に100コピー程度しか存在しなければ、そのプライマーでは検出できない感度なのかもしれません。 せめてプラスミドが1000コピー、いや100コピーでもPCRで検出できたらプライマーの問題、もしくはPCRの感度の問題ではないといえると思います。 参考 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/experiment/lifescience/img/test04.pdf

(無題) 削除/引用 No.180-37 - 2012/02/22 (水) 16:07:15 - AP >プライマーの3'末端がSNPsになってしまっている可能性はありますか？ exon 4-6をRT-PCRをしてシークエンスしているのだから、exon 5'にSNPがあれば当然把握しているはずのことですね。

(無題) 削除/引用 No.180-36 - 2012/02/22 (水) 16:02:42 - AP >plasmidではかかるが、cDNAでPCRがかからない >いや、今でも私が欲しいのはcDNAをテンプレートに、Ex4-Ex5'プライマーでのびしっとした一本バンドなのです。 そりゃ、目先の問題はそうでしょうとも。そういう固定観念に固執しているところが、ご自身で問題の本質をつかんでないいじゃないかと思うところなんでですが。問題の本質はそういうことではなくて、先に指摘した問題点に合理的に答えられない限り（実際そうかどうかは分からないにしても）「群盲像をなでる」だけで、だれも有効な解決法を提示できないでしょう。 結局「cDNAプールはクローニングされたDNAとは違うのだから増えないこともあるだろう」という路線の回答ばかりになって、じゃあなんでExon4-6では増えるんだということは考慮されず、さらに回答に「私のきいてるのはそんな事じゃない、同意できない」と文句を言われても。言っておきますが、ポイントを外れた回答があったり、議論がねじれたりしているのも、最初に指摘したようにあなたのリテラシー不足が招いているんですよ。

(無題) 削除/引用 No.180-35 - 2012/02/22 (水) 15:46:29 - お粗末君 5'を含むｍRNAが本当に存在するとして書きます。 ｃDNAの由来するプラスミドのPCR阻害がないようなので次に試していただきたいのは、 exon6のプライマーで増やした産物を用いて 5'のプライマーでPCRがかかるかです。 かからなければ、何らかの変異のせいかもしれません。 それでかかるようであれば、ｃDNAの5'付近の状態に問題があるかもしれないので PCR前にｃDNAを一度、加熱急冷してみたり、するとどうでしょう？ （このような経験はありませんので、いいがかげんな推測です。）

(無題) 削除/引用 No.180-34 - 2012/02/22 (水) 15:39:31 - あああ プライマーの3'末端がSNPsになってしまっている可能性はありますか？ プラスミドを作った時に使用した大本のサンプルとcDNAを作ったサンプルのプライマー結合領域の3'末端が違う可能性もありますかね？ かなり遺伝的に均一化された動物を使われているのであれば、それもほぼないでしょうけれど。

(無題) 削除/引用 No.180-33 - 2012/02/22 (水) 15:27:16 - う あ、すいません、また誤解されそうなので追記です。 理屈は分かりません（ありません）が、４−５ダッシュ−６をクローニングしたのは たまたまだった可能性も無くもない。 つまり、そもそもcDNAの溶液には４−５ダッシュ−６のcDNAが存在しない、 という可能性です。 では、４−５−６よりも大きい４−６プライマーで増えるDNAは何か？ ４−５ダッシュ−６とは違う配列を持ったDNAであるとか。 例えば、 クローニングした４−５ダッシュ−６はたくさん（いくつか）あるバリアントのひとつで 大部分はほかの配列を持った100bpほど大きなバリアントであるとか。 ４−５ダッシュ−６のcDNAをクローニングした経緯がわかりませんので 適当な話ですが、 例えば、PCR産物は増幅したものであるので、変なDNAがPCR初期にたまたま増えると もとのcDNA溶液中を反映しないものをクローニングする可能背があるので。 ま、屁理屈と取られても仕方がありませんが、 普通考えたらバンドが出るはずなのにでないというのは、 普通でないことが起こっている可能性があるからと思うわけです。 なので、 目的産物とプライマーの配列をチェックした方がいいのでは？ です

(無題) 削除/引用 No.180-32 - 2012/02/22 (水) 15:18:45 - う どうも私のコメントはお気に召さないようなのでなんですが、 伝わらない内容に誤解した人が１人いたということで 勘弁して下さい。 ＞プラスミドでもPCRはかからないと思います。 そのようなことは、わかっています。 目的産物とプライマーの配列をチェックした方がいいと申し上げたのは、 ４−６のプライマーでPCRすると、 ５ダッシュを含む「だろう」と思われるバンドは検出する そのようなcDNAを含む溶液Aを用いても ４−５ダッシュのプライマーでPCRすると バンドがでない。 で、PCR様は、思い当たる理由がない。 私にも無い。多分他の人にもない。 で、最後の可能性（ここで低いからと無視するのは簡単ですが） クローニングした　４−５ダッシュー６は何かの間違いでクローニングできたDNAである。 ということです。この断片はPCRで増やしただけで、他のノーザンとかで調べていないなら （調べていても大きさだけ同じバンドがあった場合）、 理屈は分かりませんが、たまたまだった可能性も無くもない。 なので 目的産物とプライマーの配列をチェックした方がいいのでは？ です。

このトピを読んでくださっている皆様へ 削除/引用 No.180-31 - 2012/02/22 (水) 15:03:15 - PCR 誤解されても困るので念のため書かせていただきますが、私が問題にしているのは、単純に「plasmidではかかるが、cDNAでPCRがかからない」のですが、なぜでしょう？プライマーもcDNAも（少なくとも私の中では）問題ないはずなのに！心当たりのある方はおられませんか？ということです。お前の心の中では問題ないはずかもしれんが、私から言わせればこれこれこういうあなたの気づいていない問題があるよ。だからそこを直してやりなおしてみれば、きっと一本バンドがびしっと出るはずだよ、というのが求めている答えです。 >うさん >もう一度、目的産物とプライマーの配列を、 何か違いが無いかチェックした方がいいのでは？ それは、プライマーの3'側の末端や末端に近いところで間違った塩基を指定していないか？ということでしょうか？もしそうであれば、プラスミドでもPCRはかからないと思います。

全69件 ( 21 〜 40 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. 3. 4. /4

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---