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(無題) 削除/引用 No.6247-22 - 2017/08/29 (火) 10:04:05 - アミロイド 名梨様 理解不足ですみません。 Fluorescent Filter-Trap Assay for Amyloid Fibril Formation Kinetics in Complex Solutions I Nasir, S Linse, C Cabaleiro-Lago - ACS chemical neuroscience, 2015 - ACS Publications 上記の論文には下記のようにありました。 The filter-membrane traps amyloid aggregates above a defined size (here, a 0.2 μm cut off was used), whereas smaller aggregates and monomers that pass through are collected in a regular 96-well plate as seen in Figure Figure1.1. The detection of fibrillar aggregates as well as smaller aggregates or monomers that pass through is performed on two different plates, where the fibrillar material and flow through are collected separately, and relies on site-specific, covalent labeling of Aβ42 monomer at a single position (via an N-terminal cysteine) with a fluorescent dye. Consequently, the amyloid fibril formation process can be followed by quantification of the fluorescence intensity of the label on the filter membrane and in the flow through. モノマーは通過していると解釈したのですがどういうことと判断したらよらしいでしょうか。膜も親水性のものを使用しておりFig. 1も通過していると解釈しました。方法のところがいまいち良く分からずイメージが湧きません。ドットブロット的なものとおっしゃっておりましたが、が面倒ではありますがご説明していただけると助かります。また、アミロイドのサイズに関わらず、分けずに同時検出できると助かります。宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.6247-21 - 2017/08/29 (火) 07:17:52 - 名梨 なんか激しく誤解してるようですが、ちゃんとググってみましたか？ filter assayは、いわゆる「フィルター」を使うのとは違いますよ。基本的にドットブロットのようなものです。 　 膜上での変性過程を経て蛋白がどれだけ膜に残るかがキモで条件検討は必要でしょうが、「未変性のアミロイド状態の蛋白が膜にトラップされる」「それは件の抗体で検出されない」「しかし膜上で変性の後に検出される」ということが示されれば、あなたの目的は達成できるでしょう。 もっとも、trickyな手法なので上手くいくかはやってみなければわからないでしょうが。 　 ちなみに、アミロイドのβシート構造は多量体だから安定して維持できるのだということを考慮した方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.6247-20 - 2017/08/28 (月) 23:29:31 - アミロイド AP様 コメントありがとうございます。免疫沈降ですが、使用する抗体はアミロイド型抗原には反応しないと思われるので、抗体が結合してないアミロイド型抗原も抗体が結合した非アミロイド型抗体も沈殿してしまい、よく分からなくなってしまうと思います。プロテインA/Gの簡易カラムで非アミロイド型抗原をトラップし、良く洗うのはどうでしょうか？遠沈より良いかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.6247-19 - 2017/08/28 (月) 22:31:47 - アミロイド 名梨様 コメントありがとうございます。フィルターを使ったとすると、フィルターを通過するものの抗原性と通過しないものの抗原性を同時に調べたいことになるので、難しいかと思いました。非アミロイド型とアミロイド型（必ずしもアミロイド繊維を形成してなくてもよくて、αヘリックスがβシートになっているものがバラバラになっていても良い）の抗体との結合能を調べたいと考えています。 しかしながら、貴重な情報をありがとうございます。研究を進めていく際に、重要になりそうな情報です。

(無題) 削除/引用 No.6247-18 - 2017/08/26 (土) 16:40:58 - AP 吸収試験自体は特殊な手法ではないので、参考資料は容易に見つかると思います。 吸収試験は、あるいは免疫沈降の古典的な方法もそうですが、基本的に抗原抗体複合体は高度な重合体となって不溶化するという現象を利用しています。 mAbだと必ずしもそうはならないでしょうけれど、pAB（血清）だということなので、長時間の静置、あるいは高速遠心くらいで上清と沈殿に分けられると思います。 免疫沈降でProteinA/G担体などを使うのは、利便性確実性がはるかに良いのと、あまり大きな重合体を作らない、Mabのような、でもできるってことでしょう。

(無題) 削除/引用 No.6247-17 - 2017/08/26 (土) 16:06:29 - 名梨 amyloid filter assay とか filtration assay でググって見て下さい。 　 これはイーストプリオンとかアミロイド原性蛋白の研究でよく使われる手法で、 簡単に言えば、PVDF膜とかを「フィルター」としてアミロイド原性蛋白を含む溶液を濾過するものです。 アミロイド化したものは膜にトラップされて残り、そうでないものは素通りする。 　 抗体の反応性を見たければ、膜状にトラップした後に「変性してないもの」と「変性したもの」を用意し、それぞれを同じ抗体で免疫染色すれば良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.6247-16 - 2017/08/26 (土) 15:50:20 - アミロイド AMIROIDOOTSU様 コメントありがとうございます。Prassの方法を見つけられなかったのですが、この方法では遠心をしても上清にあるのでしょうか。 論文を調べましたが、可溶性アミロイドと不溶性アミロイドの２つに分けているものを見つけました。分ける時には超遠心をしていました。なお、沈殿物を可溶化するときは蟻酸を用いていました。なので、水だけでは全てのアミロイドを溶かすことはできないのかなぁと思いました。 ELISAでアミロイドを調べているものについては調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.6247-15 - 2017/08/26 (土) 14:48:10 - アミロイド qq様 そうでしたか、「不溶性の抗原を沈殿させて、そこに結合する抗体を見る」ということだったのですね。 「アミロイドなので不溶化してしまい、固相化ができません。」の件ですが、まだ実験には着手しておらず、論文上で超遠心により落としていたので、「不溶化していれば固相化できないだろう」と思いました。 おお様がおっしゃるように「初期はそんなに多くの分子が凝集しているわけでない」のであれば、ある程度は固相化できて差はみれるかもしれません。ただ、アミロイドの抗原性が落ちているのか、固相化できないアミロイドがあるので抗原性が低く見えるのか、が分からなくなるだろうと思いました。 私の読んだ論文では、超遠心によりアミロイドを回収し「再溶解して」抗体の反応性をみる。というものでした。しかし肝心の再溶解の方法が記載されておりませんでした。他の論文も調べてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6247-14 - 2017/08/26 (土) 14:27:56 - アミロイド おお様 アミロイドを扱った経験はありません。超遠心ができればいいのではと思っているのですが、私たちがいる研究棟では持っているのが１研究室だけ。その研究室の先生にはひどいパワハラを受けているので関わりたくはないです。私的なことですみません。

(無題) 削除/引用 No.6247-13 - 2017/08/26 (土) 14:20:25 - アミロイド toto様 ちん○様 申し訳ございません。言葉には気を付けます。

普通に水に溶かせばどうよ。 削除/引用 No.6247-12 - 2017/08/26 (土) 11:05:21 - AMIROIDOOTSU 暑い中お疲れさまです。よくしらないけど、ミリQ水とか蒸留水に溶けるとおもう、たぶん。アミロイドやってるなら知ってるとおもうけど、Prassの水抽出法ってこの分野では有名な古典的精製法があるくらいだし。あと病理組織切片とかではコンゴー赤とかチオフラビンとかでアミロイド沈着を検出することある。 てかAβとかみたいにはげしく研究が進んでるアミロイドのはELISAもいろいろあるんじゃないかとおもうので、ならそういうのではどうやっているかとか参考になるのではないか。

(無題) 削除/引用 No.6247-11 - 2017/08/26 (土) 10:00:58 - qq >それともレジン付きプロテインAなどで落としますか？ プロテインAを使っちゃダメなんじゃない？抗体を沈降させるのではなく不溶性の抗原を沈殿させて、そこに結合する抗体を見る。もしくは、上清に結合しなかった抗体を見るということです。ただ、全てがアミロイド化していないと、問題を複雑にするかもしれません。 「超遠心が必要ですか？」との質問ですが、最初に「アミロイドなので不溶化してしまい、固相化ができません。」と言っているので、超遠心が必要なほどのものだとは到底思えません。逆に、沈殿しないのであれば、そのまま固相化してELISAに持っていけるんじゃない？？そうすると、何の問題も発生しない。 超遠心が必要なのは、アミロイドを含んだ試料液から、アミロイドをできるだけ完全に除去すると、アミロイドの核がなくなって、アミロイドの成長がなくなるという感じの研究なのではないかな？

(無題) 削除/引用 No.6247-10 - 2017/08/26 (土) 05:44:08 - おお >論文上ではアミロイドを落とすのに超遠心をしていましたので微妙ですが。 あなたが見たいアミロイドが沈降してくる遠心力があれば、それで解決するような気もしますけど、、、経験上どれくらいの遠心で落とせるかわかっていると想像しているのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.6247-9 - 2017/08/26 (土) 01:53:53 - ちん◯ 「そうそう、実験は精製したタンパク質で行います。」 そうそうって。 匿名の掲示板だからといってそのような言葉を使われるのなら、そりゃあ関係は悪くなるでしょう。と思ってしまうのは私だけでしょうか。 >[Re:8] アミロイドさんは書きました : > toto様 > > アドバイスありがとうございます。色々な方法がでてきてなるほどと思いました。ただ、超遠心がネックです。身近なところに超遠心機があるのですが、その研究室の先生と私はもう二度ともとには戻らないほど関係が悪くなりました。実験以外のところで障害があるのは辛いです(笑)。

(無題) 削除/引用 No.6247-8 - 2017/08/26 (土) 01:21:17 - アミロイド toto様 アドバイスありがとうございます。色々な方法がでてきてなるほどと思いました。ただ、超遠心がネックです。身近なところに超遠心機があるのですが、その研究室の先生と私はもう二度ともとには戻らないほど関係が悪くなりました。実験以外のところで障害があるのは辛いです(笑)。

(無題) 削除/引用 No.6247-7 - 2017/08/26 (土) 01:15:57 - アミロイド qq様　AP様 なるほどです。溶かさないという手があるのですね。落ちた方を調べるのも、吸収させた方をみるのもよさそうです。 ちなみに抗原‐個体複合体のみの場合は、超遠心が必要ですか？それともレジン付きプロテインAなどで落としますか？超遠心はできる環境にありませんので。 抗体を吸収させてアミロイドを落として上清をみるって手はどうなんでしょうか。ただ、論文上ではアミロイドを落とすのに超遠心をしていましたので微妙ですが。 そうそう、実験は精製したタンパク質で行います。

(無題) 削除/引用 No.6247-6 - 2017/08/25 (金) 22:17:46 - toto 古典的なvelocity dedimentationがつかえるかもしれません。グリセロール勾配を作っておいて、その上に、サンプルと抗体を混ぜたのを載せて、超遠心すると、アミドイドは底に、そこまで行ってない可溶性のものは、上の方に残るはずです。抗体の分布をみてどこに結合しているかを知るで、どのフォームに結合するかがわかるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.6247-5 - 2017/08/25 (金) 18:39:31 - アミロイド おお様、コメントありがとうございます。 ２点考えていて、アミロイドの伸長具合で抗原性が減っていくかと、異常型になったものを個々の分子にばらしてみて抗原性が減るかです。なのでそれなりに成長したものも調べたいです。初期の測定も超音波処理も後者で良さそうですね。 ３つ目はアイデアは面白いですね。正常型は一回で必要量固相化し、アミロイドは最初に核となる量を固相化後、ブロッキングしてから伸長といったところでしょうか。ただ、これだと両者で同じだけの量が固相化できるか分からないですけど。アミロイドの確認はELISA後にそのプレートにThTを入れれば良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.6247-4 - 2017/08/25 (金) 17:41:31 - AP アミロイドはどこかの細胞にできるんでしょう？ IHC, ICCで見るってのは 定量的にやるとしたら、、、、 アミロイドは単離精製できるんですね。 じゃあ、吸収実験で抗体の吸収量を調べたら。 普通は抗原溶液に抗体を加えて、免疫沈降上清からどれだけ抗体が減るか（力価が下がるか）で評価するんですけどね。 この場合、一定量の非アミロイド型、アミロイド型タンパク質に吸収された抗体量を調べる（抗体に対するWBとかELISA)なんかができるといいかな。そういう方法があるかしらんけど。

(無題) 削除/引用 No.6247-3 - 2017/08/25 (金) 17:40:13 - qq 不溶化しているアミロイドを溶かそうとしないで、溶けないアミロイドに抗体が共沈降するかを調べれば？

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