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(無題) 削除/引用 No.6322-3 - 2017/09/17 (日) 11:49:01 - mon 薄まるけど「ゲル濾過」かイオン交換（塩濃度のステップワイズ溶出で精製できるとシリンジでも可）

(無題) 削除/引用 No.6322-2 - 2017/09/17 (日) 11:29:56 - う 透析も結構ロスりますよね。溶出前の洗浄方法とか聞かれてはどうですか？1mg/mlまで濃縮できて、目的のバンドが大部分なら問題ないかとも思ったり。

GST融合タンパク質の精製後の夾雑物 削除/引用 No.6322-1 - 2017/09/17 (日) 10:04:22 - コンブ 　いつも勉強させて頂いております。 　最終的には、ヒトの膜タンパク質のExtracellular Domainに対するモノクローナル抗体の作製を目指しております。抗体作製は専門会社に相談しているところです。 　GSTタグを付けて大腸菌ArcticExpressで発現させて、Gulutathione Sepharose 4Bで精製を行いました。もともと溶出効率が非常に悪く、ほぼビーズに残っている状態であったのを、溶出バッファーはビーズ容積に対して2倍量、組成は50mM Tris, 300mM NaCl, 50mM reduced Gulutathione, 3mM DTT, 0.1% Tween-20, 20% Glycerol, pH8.8で、複数回に分けて少しずつ回収してAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units（with Ultracel-10 membrane 10 kDa ）で濃縮を行いました。 　濃縮後のCBB染色で目的タンパク質のバンドは必要濃度（1mg/ml）得られたことは確認できたのですが、10kDaより下の5kDa周囲にスメアのような染まりがくっきりあり、これが何であるか、どうやって取り除くかを検討しております。抗体作製会社の担当者にも聞きましたが、これが何であるか分からないが、取り除いた方が良いと言われてしましました。 　GST+目的タンパク質は33kDaで、フィルターのサイズを初めから30KDaにしておけば良かったのかも知れませんが、やっと得られたタンパク質をロスするのも怖く抗体作製会社の勧めもあって10kDaで濃縮しました。 　この低分子の夾雑物を取り除く算段は、透析が確実でしょうか。よろしければ方法と使用するキット・製品等をご指南頂けますでしょうか。 　私も現在のラボに来て初めてタンパク質精製を始め、またボス含めたラボメイトにも精製に詳しい者もおらず、いつもこちらの過去ログで学ばせております。ご教授頂けると幸いです。

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