BioTechnicalフォーラム [GFP強発現細胞でのAlexa iFloor488-ファロイジン染色]

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(無題)

No.6660-5 - 2018/02/08 (木) 12:03:42 - 774R

追記

メタノールのせいでGFPが変性して蛍光が暗くなることはあるかもしれませんが、それはクエンチではないですよね。

(無題)

No.6660-4 - 2018/02/08 (木) 11:57:34 - 774R

解決策は思い浮かばないけど、ひとつ気になったことが・・・

>GFPは100％冷メタノール、10分の固定よりほぼ完全にクエンチすることを知っています。

これって本当にクエンチしてるんですか？
メタノール固定でGFPタグを付けたタンパク質は観察できますよ？
もしかしてメタノールで脱膜したせいで可溶性のGFPが細胞から流出してるだけではないですか？

アクチン骨格を見たいなら、ホルムアルデヒド等の強い固定が望ましいと思いますが、可溶性のGFPも固定されてしまい観察の邪魔になりますね。

なので、蛍光ファロイジン染色の前にGFPをブリーチングするしかないですが、アクチン骨格に影響を与えずに行う必要があるわけですね。
理論的には励起光に晒せばブリーチングするはずですが、どの程度の強度でどれくらいの時間行えばいいかはやってみないと分からないですね。

(無題)

削除/引用

No.6660-3 - 2018/02/08 (木) 11:45:50 - AA

組織だと熱をかければ完全に退色するけど、細胞では厳しいですね。

(無題)

削除/引用

No.6660-2 - 2018/02/08 (木) 11:44:44 - AP

そういう目にあったことないので自信はないが、

メタノールがだめというのは、それで固定するとアクチン繊維が脱重合してしまうからだったはず。なので、固定はPFAなんかでやってから、クエンチのためのメタノール処理をしたらどうだろう。

GFP強発現細胞でのAlexa iFloor488-ファロイジン染色

削除/引用

No.6660-1 - 2018/02/08 (木) 11:16:47 - 学生

とても初歩的な内容で恥ずかしいのですが、困っていましてお助けいただけませんでしょうか？

今、プラスミドを導入した細胞において、アクチン細胞骨格がどう変化するか調べようとしています。
いただいたプラスミドがGFPを共発現することを知らなかったので、Alexa iFloor488-ファロイジンをアブカムから購入してしまいました。

どうにかGFPをクエンチして、Alexa iFloor488-ファロイジンでFアクチンを染められないか考えています。

これまでの私の数少ない経験から、細胞蛍光染色において、GFPは100％冷メタノール、10分の固定よりほぼ完全にクエンチすることを知っています。なので、今回も100％冷メタノールで固定したのち、Alexa iFloor488-ファロイジンで染めてしまえば問題ないだろうと考えていたのですが、調べると100％冷メタノールではファロイジンで染らなくなるとかかれてある文献をよく見ました。

慌てて今アブカムという会社から、Alexa iFloor594-ファロイジンを注文してはいるのですが、もし来週月曜のミーティングに試薬が届かなければ、Alexa iFloor488-ファロイジンでどうにか染められないかと思っています。みなさまの中で、GFPを4％PFAなどの固定の過程でクエンチする方法をご存知でしたら教えていただけませんか？ブリーチするにもどういった方法で行えばよいのかわかりませんので、もし、蛍光灯などの下にサンプルをしばらく置いておけば勝手にブリーチされる、との方法等ありましたら、いいな、と思っています。いかがでしょうか？GFPは蛍光顕微鏡下ではバンバンに光っています。。

宜しくお願い致します。

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