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(無題) 削除/引用 No.6918-7 - 2018/05/18 (金) 07:50:41 - タンパク初心者 ニッケルビーズの時にはイミダゾールで溶出されるんです。 綺麗に精製できています。 けれど、そのグルタチオン溶出液に還元型グルタチオンビーズを加えて、さらに終濃度1mMのDTTを加えると、ビーズに強固に結合してしまったのか、溶出バッファー（25mM還元型グルタチオン、pH8）を加えても溶出されませんでした。 ニッケルビーズの時には溶出されて、GSTでは溶出されなくなるというのはどう解釈したらいいのでしょうか？ニッケルビーズの際には不純物があって、可溶化をそれが助けていたのに、GST精製するとそれがなくなるため、GSTタンパク質が不溶化した、と考えていますが、うーん、本当かなという感じです。 どうしたらいいでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.6918-6 - 2018/05/18 (金) 04:52:24 - タンパク初心者 あげてみまっす...

(無題) 削除/引用 No.6918-5 - 2018/05/17 (木) 06:53:09 - タンパク初心者 そうですか... ニッケルビーズで最初精製した時には500mMイミダゾールinリン酸バッファーで溶出したんですが、そこにグルタチオンビーズと1mMDTTを加えて4度で転倒混和させました。 どの段階でアグっているのでしょうか？ グルタチオンビーズ表面に大量の組替えタンパク質が結合したからなのか、そもそも結合とかではなく、凝集して不溶化してしまって、見かけ上ビーズに結合しているように見えるだけなのか（その場合、column充填後の洗浄ではのぞけないですかね？）、溶出時に瞬間的にアグってしまったのか... 高濃度の塩や界面活性剤を加えるといいかもしれないとありますが、加えることで溶出が可能になったとして、その後そのタンパク質を塩や界面活性剤を加えないでダウンストリームの実験に使えますかね？つまりGSTプルダウンアッセイなどにです....

(無題) 削除/引用 No.6918-4 - 2018/05/17 (木) 06:37:29 - おお 乾いて結合する場合もあるだろうけど、タンパク質の性質上ゲルに吸着しまっている可能性もあるのでなんとも言えませんが、乾いたのが原因とすれば見かけ上水分がなくても、ゲルは湿っているでしょうし、完全に全部吸着するだろうかとも思います。

(無題) 削除/引用 No.6918-3 - 2018/05/17 (木) 06:09:41 - タンパク初心者 おおさん そうなのですね.......実はですね、そのオープンカラムを10分ほど目を離した隙にウォッシュバッファーが流れ切っており、たぶん5分ほど乾いてますね。これが原因でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6918-2 - 2018/05/17 (木) 05:42:54 - おお Probably yes.

ビーズが乾くとタンパクって出てこないですか？ 削除/引用 No.6918-1 - 2018/05/17 (木) 05:30:45 - タンパク初心者 今大腸菌の可溶性タンパクを精製しようと思ってましてニッケルビーズで精製したものにグルタチオンビーズを加え、8時間4度で回転混和させてました（バッチ法）。そのあと、20mMトリス150mM塩で洗ったのち、25mMグルタチオンでタンパクをビーズから解離させようとしました。 がここで問題が発生しました。フロースルーにはタンパクがないことから、ほぼビーズに結合してくれていそうなのですが、25mM還元型グルタチオンでは物が全く出て来ませんでした...ディスポのクロマトcolumnを使いました。ビーズの量はたったの500マイクロリットルにも関わらずいつもより流速が遅くて変だな、とは思いましたが、その不安が的中したのかcolumn内で不溶化してしまったのではないかと考えてます。 これはやっぱりcolumn内凝集なのでしょうかね？

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