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(無題) 削除/引用 No.7046-17 - 2018/07/03 (火) 16:35:32 - コンタミ原因解明中 皆様コメントありがとうございます。 こちらのラボでは基本的にペニシリンストレプトマイシンを 培地に入れることになっていますので気づいていなかっただけ という可能性は十二分にありうると思います。 同じ細胞を新たに入手する目処もつきましたので、 そちらを使ってコンタミがどうなるか確認する予定です。 液体窒素保存が基本であるのは承知しております。 あるいは気相で保存する場合でもディープフリーザーを -120度設定などで動かしているラボも知っておりますが −80度というのは私も初めてでした。 液体窒素タンクもあるのですが、前任の話を聞くと、 どうも他のメンバーがサンプルの冷却目的でガンガン汲み出すせいで 水位(?)を保てず細胞が死ぬことがあったため、-80度で保管することにしたようです。 そもそもコンタミかどうか、というのももっともなご指摘で、 現在まで、基本的には視認しているのみで判断しております。 ただ、高倍率で細胞よりかなり小さい黒点が、一晩立つと ブドウ状にくっついて増えている＋浮遊物が増加する ということからコンタミではないかと考えておりました。 何がコンタミしているかの特定よりもコンタミしないようにすることが 先決かとおもって後回しにしていましたが、染色などで確認してみようと思います。 (ラボに何故かクリスタル紫があったのでグラム染色をしてみます)

(無題) 削除/引用 No.7046-16 - 2018/07/03 (火) 14:12:28 - おお ＞細胞のストックは液体窒素が基本です。マイナス８０度保存では半年も経つと細胞は死んでいくよ。 HEKとかなら大丈夫だけどね。まあ開け閉めの頻度とかで影響が出ることはあるだろうけど。

(無題) 削除/引用 No.7046-15 - 2018/07/03 (火) 14:02:29 - おお いやー、コンタミはマイコやウイルス以外なら見たらわかると思うけどなぁ。。。 特にバクテリアなら最初は区別つかなくってもどんどん増えて培地がにごってくるし。 酵母基本的ににごってくるでしょうけど、形、大きさ的にそろったもの（球形とか）がどんどん増えてくる。 カビ類なら菌糸が伸びたりととにかくゴミや細胞のデブリより規則性があるものが増えてくるし。

本当に細菌？ 削除/引用 No.7046-14 - 2018/07/03 (火) 09:39:21 - KIO ”40倍レンズでみると黒い丸のようなものが、一晩たつと増えています。”とありますが、それは本当に細菌（あるいは真菌、酵母）？ 解凍直後であれば、死細胞の一部かも？ 細胞種によっては細胞分裂に伴い、細胞片が培地中に出ることもあるよ。 まずは https://www.funakoshi.co.jp/contents/3696 などで本当にコンタミかどうか調べてみては？ コンタミしている細菌種を特定するなら http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100007154 はいかが？ ＰＳ 細胞のストックは液体窒素が基本です。マイナス８０度保存では半年も経つと細胞は死んでいくよ。

(無題) 削除/引用 No.7046-13 - 2018/07/03 (火) 09:25:09 - TS >ただ単に以前は気付いていなかっただけでは？ 私もこれに一票。あたらしい細胞は買えないのですか。貴重な株？

(無題) 削除/引用 No.7046-12 - 2018/07/03 (火) 09:13:39 - み >[Re:11] そもさんは書きました : > コンタミが起こる以前はストックから普通に起きてたなら、ストックの問題の可能性は低いと思います。 ただ単に以前は気付いていなかっただけでは？

(無題) 削除/引用 No.7046-11 - 2018/07/03 (火) 06:05:07 - そも コンタミが起こる以前はストックから普通に起きてたなら、ストックの問題の可能性は低いと思います。 試薬類を全部新しくしても駄目ならピペットの汚染が原因のような気がします。 電動ピペッターのフィルターやピペットマンはクリーンになっているでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7046-10 - 2018/07/02 (月) 15:27:16 - み >[Re:9] コンタミ原因解明中さんは書きました : > > やはり気相でコンタミというのは考えづらいですよね。 > その後、HEK以外の株を起こしてみても同様のコンタミが起きたので > やはりストックが問題ではないのではないかと考えております。 > 全てのストックがコンタミしている可能性は否定できない。 新たに作製しなおしたmediumをdishに入れてincubatorに置いている限りではコンタミしないのでしょ。

(無題) 削除/引用 No.7046-9 - 2018/07/02 (月) 12:04:27 - コンタミ原因解明中 皆様コメントをありがとうございます。 やはり気相でコンタミというのは考えづらいですよね。 その後、HEK以外の株を起こしてみても同様のコンタミが起きたので やはりストックが問題ではないのではないかと考えております。 となるとまたなにが原因なのか、ということにはなってしまいますが、 培地はやはり可能性としては一番ありそうだと思い、 0.2umのボトルフィルターでろ過滅菌してみましたがやはりだめでした。 ベンチのフィルターについては、確かにしばらく変えていないと思います。 空調は逆に最近、施設側による交換がありましたので、 以前と変わった点という意味では可能性もあるかもしれないと思います。 どちらも時間がかかりそうなので後回しにしていましたが、真剣に検討したいと思います。 コンタミが進行中のラボの細胞を受け入れてもらうのは気がとがめますので まずは周りのラボからストックを分けてもらって 同じ操作でコンタミが生じるか調べてみたいと思います。 経過あり次第またご報告させていただきます

(無題) 削除/引用 No.7046-8 - 2018/07/01 (日) 19:07:41 - qq ここで、新たに抗生物質を添加するよりも、抗生物質なしで培養してみるべきでしょう。 その他、細胞培養で使用するトリプシンやPBS、その他のピペットなども怪しい。 なによりも、コンタミしているのか、たんなる気のせいなのかもはっきりさせるべきです。 今のコンタミショックの状態では難しいと思いますが、ペニシリン＋ストマイを入れないで培養するほうが、結果的にリスクが低いのではないかと思います。ま、ラボのルールに縛られるわけですけどね。

(無題) 削除/引用 No.7046-7 - 2018/07/01 (日) 18:44:42 - おお あ、ファンギゾンはバクテリアにはあまり効果がないと思いますので、どうしても加えるならカナマイシンとテトラサイクリン系などじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.7046-6 - 2018/07/01 (日) 18:42:28 - おお >液体窒素中だと液体窒素を介して感染が広がることがあると聞いたことがありますが リスクとしてあるという事だと思います。臨床では１％のリスクでも、感染したものを患者に使うと大問題なので低い可能性でも問題として捉えなければいけませんから。実際にそういう事例があったのは事実ですが、それまでは問題なく使っていたというのも本当のところだと思います。 気相だとどうかとか詳しくはわかりませんが、全部に広がり１００％感染というのはちょっとどうかなとおもいます。 直接的な原因の示唆はできませんが、ストックがタンクの中でコンタミしたというのを追求するよりももっとほかを見ないといけないかと思います。 もし近くの研究室でコンタミしてない細胞をもらってきてあなたの実験室でしばらく培養したらコンタミするでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7046-5 - 2018/07/01 (日) 18:29:36 - moz とりあえずは、カナマシンかゲンタシンかな。。

(無題) 削除/引用 No.7046-4 - 2018/07/01 (日) 17:03:46 - 独り言 気相で空気感染は聞いたことがないですし、そんな頻度でおこるとも思えないので、他に原因があるような。 培地だけでコンタミが見えないのは、コンタミの増殖に細胞の代謝物質が必要な場合もあるので、細胞が根源とはいえないと思います。 異なる保存日や細胞でも起こるということは、培地関連が根源かもしれません。 FBSとかPBSとか共通の試薬か、クリーンベンチのフィルターが異常に汚れているとか。共通のものではないでしょうか。 近くの培養細胞を扱っているラボで、自分のストックを起こしてもらってみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7046-3 - 2018/07/01 (日) 14:22:42 - vbhjkl； チューブからチューへの感染拡大は無いともいます。細胞の凍結保存液が原因か、あるいは10年前からオリジナルがすでにコンタミしていて、気がつかずに使用してそれをときどき凍結保存してきたかではないかとおもいます。 HEK等は安価で容易に入手出来るのですし、原因究明にいつまでも時間を使わずに新しいものを購入したほうがよいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.7046-2 - 2018/07/01 (日) 14:10:11 - うん かなり深刻ですね・・・ -80度に保存とのことなので、結構死細胞が増えてきて細胞内容物がメディウム中に出ているだけというわけではないですか？ P＋Sは入っているようですし、ファンギソンでも入れてみますか？？

気相保存中の細胞ストック間でのコンタミ 削除/引用 No.7046-1 - 2018/07/01 (日) 12:26:17 - コンタミ原因解明中 いつも勉強させていただいております。 HEKなどの細胞株を使った細胞培養実験をしたいのですがすぐにコンタミが発生してしまい困っています。 はじめは自分の手技が原因だと思ったのですが、研究室内の誰にやってもらってもコンタミが起きます。 インキュベーターを一旦止めて中の清掃と、棚板等の乾熱滅菌をし、 試薬類はすべて一新したのですがやはりコンタミが起きます。 コンタミはおそらく大きさ的に細菌だと思われ、40倍レンズでみると黒い丸のようなものが、一晩たつと増えています。 培地はDMEM+10%FBS/ペニシリンストレプトマイシンで、 培地だけを入れた場合では、コンタミは見られません。 こうなるとストックが原因かと思い、研究室内の別のストックを起こしたのですが、 どれを起こしても同じコンタミが起きてしまいます。 ストックしたひと全然違うものを起こしても全滅、 よりオリジナルに近いように10年以上前のストックを 起こしてもだめでほとほと困ってしまっております。 こちらの研究室では細胞を−80度の冷凍庫で保管しているのですが、 気相で保管してもチューブからチューブの間でコンタミ等起きうるものでしょうか？ 液体窒素中だと液体窒素を介して感染が広がることがあると聞いたことがありますが、、、 原因や対応策など、ご教示いただけますと幸いです。 どうぞよろしくおねがいします。

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