BioTechnicalフォーラム [mini-geneスプライシングアッセイ]

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(無題)

No.7073-17 - 2018/07/23 (月) 11:27:25 - mini-gene

おお様、moz様、

ありがとうございます。やはりそうですよね。

なので解決策は150bp程度のイントロンをエクソン25前とエクソン27の後ろに持たせないといけないですよね？

これですっきりしました。

https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/exontrap.html?pdf=K2010.pdf

プライマーは遺伝子上のものと、ベクター上のものの両方を持っていますので、それで検討してみます。
ありがとうございます！

(無題)

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No.7073-16 - 2018/07/23 (月) 06:16:46 - moz

コンストラクトをまとめると、以下のようですね。
splicing donor site (ベクター)- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1-splicing acceptor site(ベクター)
これならおおさんの指摘通り、splicing productは、ベクター5'：exon26：ベクター3'、およびベクター5'：exon26：exon27：ベクター3'ですね。
donor siteやacceptor siteの強さによっては、exon26（あるいはexon27,
あるいは両方)を飛ばしたりするaltanative splicingが生じる可能性もあります。
splicing productには、exon25配列は含まれない可能性が大きいので、ベクター5'上とベクター3'上にPCRプライマーが設定されていなければ、splicing productの検出は難しいでしょう。

(無題)

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No.7073-15 - 2018/07/23 (月) 05:33:30 - おお

＞exon25と２６の間のintron、exon26と２７の間のintronはアクセプターとドナーがあるので機能するはずです。

と書きましが、よく考えると上流のベクターのスプライシングサイトがあるので、そこからExon 26やExon２７、またはベクターの下流のエクソンの５’側までが飛ばされるので、exon25を含むRNAはできないですね。だから、exon25にプライマーを設定しても最終プロダクトは検出できないでしょう。なのでこのコンストラクトは考えているようには機能しないだろうと思います。

＞結果は予想外（？）なことに、PCR後のアンプリコンはバンド（1300bp）はどの予想サイズよりも高めの1300bpほどだそうです。

ということですが、これは未消化DNAからの検出か場合によってはスプライシングされる前のRNAを検出したのかもしれません（Pre-mRNAはいい条件が整っていれば検出できますので）。

(無題)

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No.7073-14 - 2018/07/22 (日) 21:37:15 - おお

exon25と２６の間のintron、exon26と２７の間のintronはアクセプターとドナーがあるので機能するはずです。

Nmdはストップコドンの位置の認識により起こるものがよく知られてます。Minigeneはタンパクをコードしてないので、どれくらい影響を受けるか不明です。そういう意味でexon25の５’側イントロンがないのがNmdに直結する理屈がよく分かりません。

かりにNｍｄがあっても、強制発現しPCRしているので見れなくもない。まあ一応CHX加えてもいいけど余計バイアスを加えているようなものかもしれないので慎重にしたほうがいいでしょう。

まあその状態では上流のベクター由来のエクソンや下流のエクソンが余分で気持ち悪いかもしれませんし、もしかしたらベクター由来のアクセプターとドナーが強すぎて真ん中のKpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1はSplice ouｔされてすべて抜けてしまっているかもしれません。

KpnIで切り出してほかの（タンパク発現用の）発現ベクターに移し変えてもらったらどうでしょうか？通常Minigeneはエクソントラップベクターじゃなくそのように作ります。

(無題)

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No.7073-13 - 2018/07/22 (日) 21:09:08 - mini-gene

mozさん、おおさん、ありがとうございます。

dTプライマーを使っています。

実は金曜にプラスミドのシークエンスをしましたらきになることかわかりました。

それはプラスミドのMCSにクローニングされていたのは、

Kpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1でした。

exon25の5'側に150bpほどのintronを入れておくべきだと思うのですが、入っていませんでした。同じく、exon27の3'側に150bpほどのintronも入っていませんでした。

これらがなければ、きっとWTでさえただしくスプライシングが起きず、Nmdが起きているのかもと考えています。シクロヘキシミド実験は失敗したので、今やりなおしていますが、どう思われますでしょうか？

(無題)

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No.7073-12 - 2018/07/22 (日) 15:18:10 - おお

個人的にはRNA分解されてないか気になるけど。

(無題)

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No.7073-11 - 2018/07/22 (日) 13:36:55 - moz

RTはN6を使っている？dTnでしょうか。
イントロン含有（1100bp）のバンドも出ないのでしょうか？
そうなら、mRNA調製>RTが問題ないとすると、転写自体が起きていない（少ない）ような。。
また、イントロン内にpimerを設計して、各intron-exon( or/and 各exon-intron)でPCRしたら、Exon or intron内に転写終結様シグナルがあるか否か判明するかも。

結果をお伝えします。

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No.7073-10 - 2018/07/20 (金) 00:25:54 - mini-gene

DNAse処理後にトリゾールで再度抽出して実験を行いました。

結果をお伝えします。
mini-geneスプライシングアッセイを行なっています。
COS-7にSV40oriを持つpET01 Exontrap（ゲノムの一部をクローン化されています。）をPEImaxで導入し、RT-PCRで一塩基変異のスプライシングへの影響を検討しています。

結果です。

オリゴdTプライマーを用いたRTのサンプルでは、GAPDHのバンドは出ましたが、RT酵素無しでは全くバンドはでませんでしたので、きちんとRTは行われ、cDNAは合成されています。

ところが、目的のプラスミドに由来するmRNAはWTさえバンドが検出されませんでした。
ポジコンとしてそのプラスミドそのものをPCRの鋳型にしており、それではバンドが強くでますので、PCRやプライマーはワークしています。

なぜプラスミドに由来するmRNAが検出されないのかを考えているのですが、

1.　COS-7への遺伝子導入効率が低い？
ただ、EGFPプラスミドを隣のウェルの細胞に導入しFCMでGFPの発現（6割以上）は確認できていますので、その可能性は低いと思います。

2.　クローニングしたゲノム断片によってmRNAの発現量が減少している？
もしかしたらWTのゲノム断片でさえ、スプライシングがうまくいかず、NMDが起きている可能性もあるのではと考えています。シクロヘキシミド（CHX）はラボにあるので、可能性を検討することは出来そうです。今夜細胞をCHX処理する予定です。

3.　他にあるでしょうか？？
私が作ったコンストラクトではないので、一度プラスミドのシークエンスは行う予定です。が、全くバンドが認められないので不安です。。もしアドバイス等いただけるようでしたらとてもありがたいです。宜しくお願いします。

(無題)

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No.7073-9 - 2018/07/13 (金) 10:15:33 - mini-gene

APさん、ありがとうございます。

RTなし、盲点でした。はい、必ずやります。
ありがとうございます。

(無題)

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No.7073-8 - 2018/07/13 (金) 09:49:22 - AP

DNaseもいいが、完璧にプラスミドを駆逐できるているかは保証できない。
RTaseなしのコントロールを必ず置くべき。

(無題)

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No.7073-7 - 2018/07/13 (金) 09:31:58 - mini-gene

おおさん、今確認しましたが、そのプライマーと相補的な部分は完全に一致してしまいました。

マウスで保存されているかどうかにつき調べたのち、マウスで行うか、プライマーのデザインを考慮して問題を乗り越えることにします。

きっとまた質問してしまうと思いますが、どうか宜しく御願い致します。

(無題)

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No.7073-6 - 2018/07/13 (金) 07:29:15 - おお

>ヒト特異的なプライマーでは緑サルのものはPCRでかからないはずですし

緑サルの配列を確認されましたか？

(無題)

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No.7073-5 - 2018/07/13 (金) 06:25:57 - mini-gene

おおさん、

ありがとうございます。
大抵ワークするのですね...かしこい実験系ですね。

私もSV40オリがあるなとは思っていました。
なので先方の方はPCRでプラスミドをひっかけてる可能性は大ですね。

SV40oriは発現しているのですが、COS7に今しがた導入してみたところです。
これであれば、エンドのものはヒト特異的なプライマーでは緑サルのものはPCRでかからないはずですし、DNase処理すればプラスミドそのものは消化されるはずなので、きっといけるはずですね。

今、コス7以外の細胞で導入しやすい細胞を探しているところです。

ありがとうございます。

(無題)

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No.7073-4 - 2018/07/13 (金) 06:00:54 - mini-gene

monさん

ありがとうございます。
私は海外でポスドクをしておりますが、この実験は初めてで大変恥ずかしいのですが、質問させていただきました。

やはりDNase処理は必須なのですね、自分の考えが正しいとわかり少し自信がつきました。ありがとうございます。

(無題)

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No.7073-3 - 2018/07/13 (金) 05:43:35 - おお

ワークするがといえば大抵ワークするだろうといえます。ただしアーティファクトも出ることがあります。

細かいことは時間があればとおもいますが２９３TはT－antigenが発現してますので細胞内のプラスミドが爆発的に複製されてコピーナンバーがかなり過剰になってしまう可能性があります。pET01のはSV40Oriがありますから。

細胞は２９３T以外にしたほうがいいかと。たとえばその親株のHEK293とか、その遺伝子が発現してそうな組織由来のものとか。Endogenousとの区別のためにはプラスミド由来のエクソンとかにプライマーを設定したほうがいいかもしれません。マウスで作ったプライマーがワークしないなら、（研究の方向性がゆるすなら）マウスの細胞に導入するというのもありえます。そうすると導入したプラスミド由来のTranscriptsが特異的に検出できますので。

(無題)

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No.7073-2 - 2018/07/13 (金) 05:22:01 - mon

一過性導入では、細胞内のplasmidコピー数は数１０-数千と言われていますので、DNase処理必須です。解釈はそこからですね。

mini-geneスプライシングアッセイ

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No.7073-1 - 2018/07/13 (金) 04:41:20 - mini-gene

ご相談させてください。

この度、ボスから時間が空いた時にやってくれないか？とお願いされた実験があります。
それはボスの他大学の生徒の実験なのですが、手技に不慣れなことが原因なのか、それとも実験がそもそもワークしないものなのかが判断出来かねるとのことで、私にそれが回って来ました。

実験は、293T細胞などにmini-geneコンストラクトをトランスフェクトし、mRNAを抽出し、RT-PCRを行うというただそれだけです。RT-PCRのアンプリコンとしてはmini-geneコンストラクトに由来するものです。

プラスミドはpET01 Exontrapという名称のようで、このMCSに興味ある遺伝子の一部分のエクソン（L、M、N）とイントロンがクローニングされています。野生型のものと、おそらくスプライスアクセプターサイトとして機能しないだろうと予想される変異体の2種類のプラスミドです。

向こうの学生の方は、エクソンMスキップ（500bp）、エクソンM一部欠失（500-650bpの間）、イントロン含有（1100bp）そして正常（650bp）なスプライシングの4通りの可能性を考えているようで、それを検出するためにエクソンLに5’プライマーを、エクソンNに3’プライマーを設計し、上記4つの可能性のうち、どのサイズのアンプリコンができるかを調べるためにRT-PCRを行なっているようです。

結果は予想外（？）なことに、PCR後のアンプリコンはバンド（1300bp）はどの予想サイズよりも高めの1300bpほどだそうです。

mini-geneスプライシングアッセイは私は行ったことがありませんが、ぱっと見の印象では、私は2つの可能性を考えています。

そもそもこのプラスミドはmini-geneスプライシングアッセイとして機能していないのでは？と考えました。なので2つのイントロンも含んでしまい1300bpほどのバンドが出てしまうのではないか？

もう一つの可能性は、このPCRプライマーは、”導入したプラスミドそのものも”鋳型としてしまうため、たとえトリゾールでRNAを抽出したといっても、コンタミするプラスミドをRT-PCRの際にひっかけてしまっているのでは？それゆえにPCRのバックグラウンドが高くなり、目的のものが見えにくくなっているのでは無いか？と考えました。

後者の可能性については、RNA抽出後にDNAse処理をすれば問題はクリアされると思います。
ただ前者の可能性については、私はこの類の実験は行ったことがないのでわかりません。
実際にはエクソン25、26、27をクローニングしているようですが、このエクソン、イントロン断片をベクターにクローニングしたら導入細胞内できちんとスプライシングはなされるようなものでしょうか？

大変稚拙で初歩的な質問かと存じますが、今実際私の手で実験を始めてはいますが、コメントをいただけますと幸いです。

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