Bio Technical フォーラム

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56件 ( 21 〜 40 )  |  1/ 1. 2. 3. /3


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No.7085-37 - 2018/08/16 (木) 06:51:30 - おお
Ligaseはワークしている確証はありますか?

(無題) 削除/引用
No.7085-36 - 2018/08/16 (木) 06:07:44 - おお
>そのプレートに50mg/mlのカナマイシン溶液を10マイクロリットル塗り、そこへ大腸菌を撒いています。

もしこれをするのなら、Transformationの数日前少なくとも前日に100ulぐらいのLBで希釈したカナマイシンを均一になるように塗り、再度プレート表面を乾燥させて置くと局所的に高濃度なカナマイシンプレートに撒くのをある程度防げると思います。

えっとベクターはpBR322Oriかなんかで大腸菌ないに低コピー数しか得られないやつじゃなかったっけ。それなら最終濃度25ug per ml (経験的に15ぐらいまで下げれると思っているけど、ギリギリまでせめてもどうかと思うので)ぐらいの濃度になるくらいまで減らすといくらか助けになると思います(絶対的な原因と言えないでしょうけど)。

(無題) 削除/引用
No.7085-35 - 2018/08/16 (木) 03:53:26 - LIC
おお先生、引き続きアドバイスくださり、ありがとうございます。

はい、UVは当てています。けれど2秒もないと思います。
ただ、これ以上実験がワークしていない以上、考えられる事はすべて除外するべきですよね。
はい、やってみます。

そしてオリジナルのものから再度、トランスフォーメーションし直してみます。

ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.7085-34 - 2018/08/16 (木) 03:40:25 - おお
ベクターなどゲルから切り出ししているときにUVを当ててませんでしょうか?長波長でもかなりダメージがあるようです。2レーンつかっていっぽうを少量ながしてUV照射用にしてもう一方は銀紙とかでUVをさえぎってUVあててバンドが見えた位置を参照して切り出すとか、工夫する手はあります。

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No.7085-33 - 2018/08/16 (木) 03:33:02 - おお
念のためオリジナルプラスミドストックからTransformationして精製しなおしてください。

すでにニックが入っていたり、それ以外のダメージでTransformation 活性が低下しているかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.7085-32 - 2018/08/16 (木) 00:12:47 - LIC
>>ターゲットにSsp1がないときは、ベクター側は脱リン酸化せずにPCRプロダクト(リン酸化はしていてもしてなくてもいい)でLigationしてその後Ssp1処理してTransformation.

>まだモノが取れていません。
>明日上記の結果が出ます。


【衝撃的な結果が出ました】

1. Ssp1処理したプラスミドをゲル抽して、その一部にライゲースを加えてセルフライゲーションを起こさせたサンプル

2. Ssp1処理したプラスミドをゲル抽して、その一部に水とライゲースを加えてセルフライゲーションを起こさせた後、再度、Ssp1処理したサンプル

3. Ssp1処理したプラスミドをゲル抽して、その一部にPfuで増やしたPCR産物とライゲースを加えてセルフライゲーションを起こさせた後、再度、Ssp1処理したサンプル

【予想される結果】

1. めっちゃコロニー出るはず

2. 期待としては0

3. 5個ほど?


【実際の結果】

1. なんとゼロ...

2. 0

3. 0


驚愕でした。。
まずaddgeneから購入したプラスミドのシークエンスチェックをしてみます。こわい。。。
そしてコンピテントセルも隣のラボから効率の良いものをもらうことにします。
実は大腸菌をプレートするLBプレートはプレインのものを使っています。抗生剤抜きのものです。

そのプレートに50mg/mlのカナマイシン溶液を10マイクロリットル塗り、そこへ大腸菌を撒いています。

この方法でaddgeneからの大腸菌は生えていたのですが、きちんとプレートから作り直します。
そしてLBアガーが冷めたらそこへカナを入れることにします。

それ以外にトラブルシュートとして考えられることはあるでしょうか?。。。

(無題) 削除/引用
No.7085-31 - 2018/08/15 (水) 22:17:50 - LIC
>ターゲットにSsp1がないときは、ベクター側は脱リン酸化せずにPCRプロダクト(リン酸化はしていてもしてなくてもいい)でLigationしてその後Ssp1処理してTransformation.

まだモノが取れていません。
明日上記の結果が出ます。


一方で、LICをもう一度見直してみました。

addgeneのLICプロトコルには、DTTを加えるようにかかれてあります。

addgene.org/protocols/lic/

ただ、私はNEB T4 DNA ligaseの説明書に従い、buffer 2.1のみでvectorとPCR産物を処理しています。

DTTを加えないことが原因でしょうか・・・
ve ctorも十分使っているのですが、Ssp1未消化に起因するコロニー(セルフライゲーしょん)すら見られないので、何かがおかしいのでしょうが・・・まだコンピを変えるというところまでは行っていません。許可がいりますので・・


LIC用のvectorとPCR産物にligaseを加えたら、通常の高効率での陽性コロニーが出現すると考えていいのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.7085-30 - 2018/08/11 (土) 11:35:47 - toto
> totoさんは「大量のコロニー」が出ると書かれていますが、どれ位でるものでしょうか?あと使ったコンピテントセルはなんでしょうか?今だと自分がやった時よりももっと効率が高いものがある(そもそもIn-FusionじゃなくてNEBuilderですね)んでしょうね。テクノロジーの進歩は早い。
>
> 全然的外れだったらゴメンナサイ。

いや、こちらこそ、この質問の部分だけしか読んでないので的外れかもしれません。コンピは自家製で(10^8くらい)、単純なベクターとインサートの2つをつなぐだけなら、コンタミンしたのかと思うくらいぎっしり生えます。数えられません。それで蒔くときに不均一に蒔いて、端の方のコロニーの隙間が十分あるところを人ってます。少量だけ蒔けばいいのですが。
inFusionだと15merしかoverlapに使わないせいか、妙なものが入ることもありますが、NEBuilderだと20merが標準でその違いなのか、2つ、3つのフラグメントをつなぐのなら、妙なのは出ないので、コロニーも2つ3つしか拾いません。ただ15merにしてもちゃんとつながるのでそのせいではなさそうです。3'端にミスマッチがあるとたまに設計通りでないのもできるのでそのときは6個くらい拾うことにしてます。InFusionは買い込んでたのでもったいないのですが。

(無題) 削除/引用
No.7085-28 - 2018/08/11 (土) 06:18:07 - LIC
おおさん、ありがとうございます!

結局昨晩、おおさんがお示しされたまさに以下を行っています。

>ターゲットにSsp1がないときは、ベクター側は脱リン酸化せずにPCRプロダクト(リン酸化はしていてもしてなくてもいい)でLigationしてその後Ssp1処理してTransformation.


結局ライゲーションじゃん...て話ですが、ライゲーションしても読み枠がずれないこと等確認できたので、もうLICは試さないと思います。時間がかかりすぎました。あああ。

ありがとうございました。明日Ssp1で再度消化した後、トラフぉします。

PS:ギャップはないタイプです。

(無題) 削除/引用
No.7085-27 - 2018/08/11 (土) 05:47:51 - おお
念のためT4pol処理後はPCRClean用カラムなどで精製してみるのはありかもしれません。

>ベクターを1ul、PCR産物を4ul(コントロールとして水4ulも用意)を30分、室温で反応

アニーリングを確実にするため70度ぐらいのお湯が入ったビーカーにつけておいて室温に戻るまで放置するという方法もあるかと。バッファーは適度な塩が入っていたほうがいいと聞きますが、検索などで見るとLigation Buffer(別にLigase処理するわけではない)を使ってたりするプロトコールがあるようです。

でも、何処が問題か見極められないと結局何やっているのかっていう事に、、、各ステップがワークしているか調べる術がないと、、、

(無題) 削除/引用
No.7085-26 - 2018/08/11 (土) 05:35:57 - おお
ちょっと検索したりしたときにたまたまデーターを見たんだけど、末端12塩基のオーバーラップで160ぐらいのクローンが得られ他というデーターがありました。

きっちりLigationするような系では一桁は多いことも結構ある。なのでコンピがしっかりしてないと難しそうです。

Ligationしてもだめということですが、そのデザインはギャップがないタイプですか?LICはアニーリングしても数塩基ギャップがあるものもありますよね。

(無題) 削除/引用
No.7085-25 - 2018/08/11 (土) 05:28:54 - おお
Ssp1切断したところから始まる塩基配列を含むターゲット増幅用プライマーを用意して、直接ブラントで掘り込んだほうが結局は早いかも。

プライマーはリン酸化のModificationを合成のときやってもらうか、PCRの前に自身でやるかあるいはPCR産物をリン酸化するか。

ターゲットにSsp1がないときは、ベクター側は脱リン酸化せずにPCRプロダクト(リン酸化はしていてもしてなくてもいい)でLigationしてその後Ssp1処理してTransformation.

(無題) 削除/引用
No.7085-24 - 2018/08/11 (土) 01:12:03 - LIC
切った張ったの世界さん、ありがとうございます。

私は自作のDH5alphaでやっています。
今回、LICの後に、敢えてライゲースを加えていつもどおりライゲーションを起こさせているのですが、だめでした。

過剰な削り込みが起きているのか、dCTPやdGTPがワークしていないのか...

(無題) 削除/引用
No.7085-23 - 2018/08/11 (土) 01:02:58 - 切った張ったの世界
おおさんが指摘されていますが

>一つだけいえることはLigationしてませんのでTransformationの効率はたいていのLigationする系より低いはず。ということはコンピが結構しっかりしてないとクローんが拾えないかも。

が原因じゃないでしょうか?

私も(は?)始めてやった時にDH5aを使って失敗した口です。InvitrogenのIn-Fusionでやって一回目DH5aでコロニー無し、二回目コンピテントセルだけ効率の高いもの(InvitrogenのOne shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli)に代えたらあっけなくコロニー出ました。ノートみたら、実際のサンプルでもキットについてたポジコンでも出てきたコロニーは20個弱でしたので、DH5aでは出ないのはまあ当然だったか。

totoさんは「大量のコロニー」が出ると書かれていますが、どれ位でるものでしょうか?あと使ったコンピテントセルはなんでしょうか?今だと自分がやった時よりももっと効率が高いものがある(そもそもIn-FusionじゃなくてNEBuilderですね)んでしょうね。テクノロジーの進歩は早い。

全然的外れだったらゴメンナサイ。

(無題) 削除/引用
No.7085-22 - 2018/08/11 (土) 00:06:33 - LIC
トピ主です。

結果はインサートなしのものと変わらず、インサートを加えても大腸菌コロニーは出てきませんでした。

プラスミドはaddgeneから購入した、pET His6 MBP TEV LIC cloning vector (1M) (Plasmid #29656)です。(www.addgene.org/29656/)
このサイトには以下のようにクローニングの手順が書かれてあります。
**************
This plasmid is an empty vector to be used with a LIC cloning protocol.

It has a TEV-cleavable His6 fusion tag on its N-terminus. MBP can enhance your protein's solubility and expression. It can also be used as an affinity tag.

To clone into this vector, add LIC fusion tags to the 5' end of your PCR primers.

Forward - 5'TACTTCCAATCCAATGCA3'

Reverse - 5'TTATCCACTTCCAATGTTATTA3'

Linearize the plasmid with SspI and gel purify.

When digesting the DNA with T4 polymerase, use dCTP for insert and dGTP for vector.
**************

これに倣い、
まずプライマーを注文しました。5’側に指示されたアダプターが付いています。
これを用い、PCRを行い、ゲルから精製、その後、NEBバッファー2.1とdCTP、T4DNAポリメラーゼを加え、20ulの系で30分室温、その後、75℃30分処理しました。

一方、ベクターの方はミニプレップ産物をSsp1で1時間消化し(この時、未消化のものも用意して、きちんと切断が起きているかと確認しています。)、ゲルから精製、その後、NEBバッファー2.1とdGTP、T4DNAポリメラーゼを加え、20ulの系で30分室温、その後、75℃20分処理しました。


ベクターを1ul、PCR産物を4ul(コントロールとして水4ulも用意)を30分、室温で反応後、DH5alphaは形質転換させました。結果はどちらもコロニーゼロでした。

同時に他のプラスミドのクローニングもしていましたが、そちらではコロニーは生えています。

LICに用いるすべての試薬は新しいです。
プライマー配列も注文し直し、正しいです。

実はLICで75℃20分処理した後、DNAリガーゼを加えたものも作製しましたが、そちらでもコロニーはでませんでした。

Ssp1はブラントでカットする制限酵素です。脱リン酸化処理もしていないのにセルフライゲーションコロニーが出ないということは、T4DNAポリメラーゼによる3’-5’exoヌクレアーゼ活性はあるのだと思いますが、、、。

dCTPやdGTPがワークしていないのでしょうか...
それとも75℃、20分の処理ではT4DNAポリメラーゼの失活は不十分でしょうか?
一応、addgeneにはこのプロトコルが載っています。
www.addgene.org/protocols/lic/

あまりに時間がかかってしまい、自分に嫌悪感すら感じ始めました。。

LICは難しいのでしょうか?
改善すべき点がありましたら、どうかご指摘いただけませんでしょうか?

どうかよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用
No.7085-21 - 2018/08/10 (金) 23:50:33 - toto
>最近はgibson assayとかin fusion等が金があるラボには好まれますが。
いや、安いのでiPS研でなくてもできますよ。Gibsonは昔ので、今はNEBuilderに代替わりしてますが、いずれにしても、効率が猛烈に高いので、ほんの少量ですみます。NEBのサイト見ると、今は10uLのマスターミックスで10本が18000円と大幅に値上がりしましたが、メーカーのいいなりに10uLのスケールではやらないでしょう。1uLも使えばligationとは比較にならないほど大量のコロニーができます。それで1uLずつ分注して(これがめんどい)、一回あたり、ロスも含めて、200円くらいでしょうか。キャンペーンでまとめて買っておけば130円くらいにはなります。0.5uL分注でもできそうですが、dry upしそうなので1uLにとどめてます。

(無題) 削除/引用
No.7085-20 - 2018/08/10 (金) 14:12:28 - asan

>これって普通の制限酵素処理したものをライゲーションするのとかわらなくないですか?
後者ではライゲースが必要で、前者(LIC)ではライゲーションが必要ないということですか?

1.LICの大きなメリットは1.制限酵素サイトを選ぶ必要がないので決まった配列を末端につければなんでもクローニングできる。
2.ライゲーションではなくて、突出末端のアニーリングによるもの(ニックは通常大腸菌内で修復される)なので、セフルライゲーション等の非特異的増幅はまず起きない。
3. 大腸菌の修復機構を利用するのでライゲーションより正答率は高い(ことが多い)。

あたりが理由になると思いますうまくやれば制限酵素処理等の後の精製過程などを省略したりして十分な活性もあるので、同じ場所に複数の異なるものをクローニングしたい場合などの時間節約が可能です。最近はgibson assayとかin fusion等が金があるラボには好まれますが。

(無題) 削除/引用
No.7085-19 - 2018/08/10 (金) 08:08:32 - ヨコシマ
通りすがりの者です。

私もLIC、初めて聞きました。
T4ポルで削り込みをさせたインサートとベクターを適当な比率で混ぜた後のトラフォメのようですが、
これって普通の制限酵素処理したものをライゲーションするのとかわらなくないですか?
後者ではライゲースが必要で、前者(LIC)ではライゲーションが必要ないということですか?

前者のコロニー出現率の効率が悪いのなら、ライゲースを前者のサンプルに加えるというのもありなんですかね?

(無題) 削除/引用
No.7085-18 - 2018/08/08 (水) 13:30:37 - あくちの
有料のGeneiousなんかは設計からPCRシミュレーション、クローニングのシミュレーションまで出来てしまうのですが、フリーではそこまではありません。

例えばクラウド型のBenchlingなんかは視覚的に見やすいです。プライマーがどこにくっつくかなども見やすいので使ってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.7085-17 - 2018/08/08 (水) 09:57:13 - LIC
あくちのさん、

デザインソフトなんてあるのですね!
フリーのものでおすすめはありましたら教えていただけませんでしょうか?

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