BioTechnicalフォーラム [なにをしてもコンタミが解消できません。たすけてください。]

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(無題)

No.7277-10 - 2018/10/03 (水) 00:12:18 - AP

ルーティンにやっているようなPCRだと多量に生じるPCR産物のキャリーオーバーで、どうしても実験環境が汚染されがちです。そういう問題があるため、反応系にdUTPを使いPCR産物がウラシルを含むようにする一方、PCR反応開始時にウラシルDNAグリコシダーゼでキャリーオーバーを分解するようなデザインのqPCR反応系があります(ThermoのPowerUP SYBRなど)。

(無題)

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No.7277-9 - 2018/10/02 (火) 22:00:35 - コンタミ

皆さん御返信本当にありがとうございます。

仰るようにフィルターも完全に信用できないので、
教授に教えてもらって、ピペット内部を洗いました。

いままではクリーンベンチではなく、実験机でやっていたのですが、
以降は場所も考えるようにします。

ネガコンはＤＮＡサンプルの代わりにＭＱを入れているのですが、
ネガコンが出てからは頻繁に新しい水に変えています。ですので、ネガコンのコンタミは考えにくいのですが。。。
配列は読んでいないのですが、ポジコンとほぼ同じ塩基配列ではないかと思っています（melt curveの解離温度が同じうえにCt値が安定してしまっている）。アニーリング温度はかんがえていませんでした！ちょっと試してみます。

ピペットを分解してUVのあたるクリーンベンチ内に一晩放置してみようと思うのですが、皆さんどう思われますか？
プラスチックの変性が少し不安なのですが。

最後にご回答いただいた皆様本当にありがとうございました。

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No.7277-8 - 2018/10/02 (火) 19:57:12 - おお

そのネガコンにコンタミしているという落ちはないですよね。。。てかネガコンって水かバッファーですか？

うーんでもコンタミだったらCt値がぶれたりしそうな気がする。配列読むまではしてないのですよね。ちょっとアニーリング温度上げたらどうなる？

場所自体を変える

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No.7277-7 - 2018/10/02 (火) 18:17:02 - ema

試薬・器具を一新してもダメというなら。
昔の話ですが、色々な実験を行なうラボで起こりやすく見えないけどエアロゾルのように壁面机などに付着しているので、研究室内で相談し私たちは「作業場所」自体を変更していました。

(無題)

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No.7277-6 - 2018/10/02 (火) 18:13:05 - mon

＞別のプライマーだとやはりネガコンが出ないので、ピペットのコンタミは無いように思います。
この認識は間違いです。コンタミしているのは「特定のプライマーペアで増えるDNA」だからです。フィルターチップも空気は通しますので、DNA断片が通る可能性もあります。ピペットマンのコンタミなら、希塩酸で軸内部を洗ってみるとか（ピストンは錆びるのでNG)、シーリング・Oリングを変えるとか？
と書きましたが、ピペットの変更はしているのですね。失礼しました。
となると、PCRチューブを入れてある袋内部が汚染しているとか？
最悪、クリーンベンチ内部の上部が汚染していて、DNAが降ってくる状況とか？
（UVを一晩点けておくとか？）

(無題)

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No.7277-4 - 2018/10/02 (火) 18:00:12 - コンタミ

返信ありがとうございます。

ダイマーではないと思っています。
理由はこのプライマを使っていて、今までネガコンが立ち上がることが無かったのに突然ダイマーが生じるとは考えにくい点。
また、melt curveを見てもポジコンと全く同じ位置で解離が起きているためです。
Ct値もポジコンと同じ位置で立ち上がっています。

以上の理由より、ダイマーなどの副産物ではなく
コンタミであると判断しているのですが、ピペット変更や試薬の全替え、プライマーも新品を注文して作成しているのに、いまだにネガコンが出るので、ほんとうに困っています。。。。

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No.7277-3 - 2018/10/01 (月) 05:24:31 - おお

Ctはどれくらいで立ち上がりますか？コンタミなのか副産物が生じているのかある程度見極めは必要だと思います。

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No.7277-2 - 2018/10/01 (月) 02:50:16 - 金

経験あります。

そのプライマーを変えれば全て解決します。
理由は不明ですがある特定のプライマーは何かを増やしているようです。あるいはプライマーダイマー。

なにをしてもコンタミが解消できません。たすけてください。

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No.7277-1 - 2018/09/30 (日) 23:18:53 - コンタミ

核ＤＮＡを対象に、リアルタイムＰＣＲを行っているのですが、
ＮＴＣ（ネガコン）に増幅曲線が立ち上がってしまいました。
今まで、特にネガコンが立ち上がることは無く上手くいっていたのに
ある日突然ネガコンが出るようになりました。
なので、使っているプライマーの配列が問題とかではないはずです。

そこから全ての試薬を新品に変えても、ネガコンに増幅が出ます。
プライマーも配列を同じものを注文しましたが、だめでした。
ＭＱも当然変えました。
ピペットのコンタミも疑い、フィルターチップを用いていますが、それでもだめです。（フィルターチップ＋新品の試薬、プライマーなど）

ネガコンが出ている遺伝子領域を対象にしているプライマーは他にもあるのですが、それだとネガコンが出ません。ピペットのコンタミを疑い無駄にピペッティングもしましたが、別のプライマーだとやはりネガコンが出ないので、ピペットのコンタミは無いように思います。
リアＰではない、Taqを使ったＰＣＲを行いましたが、ネガコン部分に増幅を示すバンドが出現します。ただ、問題のプライマー以外を用いた場合はネガコンで出現はありません。

どれだけ新品、クリーンベンチ内、フィルターチップで気を使っても、かならずネガコンに立ち上がりが出ます。
上記のように全てを試しましたが、ことごとくだめで、もう鬱になりそうです。

どなたか些細なことでも良いのでアドバイスを頂けると幸いです。
どうかよろしくお願いします。

対象サンプルは藻類で、遺伝子領域はその属にspecificな遺伝子領域。
リアルタイムＰＣＲの試薬はＴａＫａＲａのSYBR Green(TB Green)です。

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