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(無題) 削除/引用 No.7441-36 - 2018/12/05 (水) 19:18:02 - AP ノジマ法なんかなら、ちゃんとやれば自作でも市販品と遜色ない性能のが作れます。時間はかかるし、ちょっと面倒だけど、実働時間はそれほどでもない。ほかの仕事の合間に片手間でやる、あるいはトレーニングの一環として若いのにやらせる。金だして買うのには積極的にはちょっとならないなあ。 保存期間、状態によって効率が下がるのは市販品も自作も同じ。 Toyoboはまさにノジマ法で、論文や寄稿で書かれている通りの能書きをつけているけど、液体窒素保存を推奨している。ディープフリーザーだとそれだけで一桁落ちると。10の9乗が10の8乗に落ちたところで実用上は何の問題もないけれど、保存期間が長くなってくると10の7乗とか6乗とか、それ以下とかで日常的に実験しているシチュエーションはありえる。 いまどきライブラリーづくりとか難しいことはやらんだろうし、単一の断片をクローニングするだけ、数は問題じゃない、という実験ばかりやっていると先王が落ちているのにも案外気が付かないし、実害もない。 そういうとことで、インサートサイズやベクターサイズが大きいみたいな、ちょっと難度があがる実験をすると、ハマりがち。そういうときは、コンピを作りなおすとか、市販品を買うとかするとかで解決することも多い。 ベクターサイズにかかわらず、全体的に効率が落ちるけど、もともと効率の落ちる大サイズが最初に全滅するのか、大きいベクターを取り込む能力から落ちていくのかはわからないけど、

(無題) 削除/引用 No.7441-35 - 2018/12/05 (水) 17:18:40 - AP >自作コンピなら話は別かもしれませんが、今時コンピの自作してるところって少ないでしょう。 それは偏見

(無題) 削除/引用 No.7441-34 - 2018/12/05 (水) 17:02:08 - 中年 うちは自作しています。半日の作業で100万円相当。

(無題) 削除/引用 No.7441-33 - 2018/12/05 (水) 15:29:11 - ligation なんというか、理屈の上ではそうだ、という話が、最近の現実の話と剥離しているように思うんですよ。 >確かに感覚と言われればそうですがたとえば、 >https://www.promega.com/resources/pubhub/enotes/comparing-cloning-efficiency-of-pgemt-and-pgemt-easy-vectors-to-topo-ta-cloning-vectors/ 出されたリンクはTAクローニングの結果であって、先に話に出している、二か所制限酵素で切ったベクターとつなぐ話とは違うでしょう。TAクローニングの方が何倍も効率が悪い。私は、「正攻法、2フラグメントを極一般的なやり方で繋げる場合、問題になるほどコロニー減りますかね？」と書いたけれど、もちろんTAクローニングの話では無い訳で、やはり自説は曲がらない。正攻法、2フラグメントを極一般的なやり方で繋げる場合はインサートの長さが極端に長い（10kbp超とか）場合でもなければどんな長さでもコロニーは大量に出る、長くても特に減りもしない。 そもそもリンク先のデータ、全体として見れば確かにインサートが長くなれば効率が落ちてるように見える、と捉える人もいるかもしれないが、私はそうは思わない。実際1.4kbpよりも3.1kbpの方がコロニー数が多い。ホワイトコロニーの割合も、750bpのインサートよりも3.1kbpのインサートの時の方が高い場合が多い。インサートが長いと効率が下がる、を示すデータにはなり得ないでしょう、これ。 さらに、pGEM-T Easy（自分もTAクローニングはこれを使ってる。10年以上使ってるように思うけれど、勘違いだろうか？値段も高くないし、かなりスタンダードなものだと思うが）を使って二回目の試行の時はホワイトコロニーの数はどれも300個も超えている。気を付けて丁寧にやれば、いつでも（インサートの長さがどうであっても）これくらいのコロニーが出て、インサートの長さによる効率の違い（仮にあったとして）があったとしても（TAクローニングでさえ）気にしなくて良いレベルになるってことなんじゃないかなあ。 >この手のデーターは古い文献を引きずり出してくるとみつかるとおもうけどなぁ。 古い文献に意味が無いとは言わないけれど、実際に即して考えれば無視しても構わなくなったデータが多いんじゃないかと思います。 >５００bp位でワークしているコンピテントを使っていてある日必要になって２kbぐらいのものを入れようとしたらうまく行かなかったという話もよくあり、コンピテントの効率が悪かったとためという結論だったっていうのがよくあります。 長さの問題じゃなくてコンピが駄目になっていたという話ですよね？しかし今時コンピテントセルってそうそう駄目になりますか？凍結融解を繰り返したとかすれば駄目になるでしょうけれど、普通一回に使う分のアリコットを作って-80Cに入れるでしょう。これ、一年や二年で効率が劇的に下がったりしませんよ。 自作コンピなら話は別かもしれませんが、今時コンピの自作してるところって少ないでしょう。人件費を考慮すれば買う方がよっぽど安くつくのは明白だから、買ってるラボの方が大多数を占めると思いますが…。

(無題) 削除/引用 No.7441-32 - 2018/12/05 (水) 12:32:17 - おお ＞これ、どれ位確かでしょうか？続きに書いたお話は別ラボでやった話とのこと、条件が違うから比較できないのではないかと思うのですが。 確かに感覚と言われればそうですがたとえば、 https://www.promega.com/resources/pubhub/enotes/comparing-cloning-efficiency-of-pgemt-and-pgemt-easy-vectors-to-topo-ta-cloning-vectors/ この手のデーターは古い文献を引きずり出してくるとみつかるとおもうけどなぁ。 また、５００bp位でワークしているコンピテントを使っていてある日必要になって２kbぐらいのものを入れようとしたらうまく行かなかったという話もよくあり、コンピテントの効率が悪かったとためという結論だったっていうのがよくあります。まあインサートの配列による相性もあるでしょうけど、ながければその相性によって成功率が大きく作用されがちなのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7441-31 - 2018/12/05 (水) 10:26:08 - 中年 サイズによる形質転換効率の差はもちろんありますが、長い断片がクローニングしにくいというのは、UVによるダメージを受けやすいことによるケースもあるでしょうね。 PCIの代替品としてStrataClean Resinはいかがですか。値段は安くないのですが、うちでは希薄溶液からのタンパク質の濃縮に使っています。

(無題) 削除/引用 No.7441-30 - 2018/12/05 (水) 10:02:25 - ligation > でも５００bとかと比べると正攻法でも相対的にTransformationでできるコロニーの数が減る傾向があるのはたしかです。 これ、どれ位確かでしょうか？続きに書いたお話は別ラボでやった話とのこと、条件が違うから比較できないのではないかと思うのですが。世間一般でもそのように言う方がいるのは知っていますが、どれだけ正確な話なのかちょっと疑っています。正攻法、2フラグメントを極一般的なやり方で繋げる場合、問題になるほどコロニー減りますかね？ レポーターアッセイ用のベクターに、インサート（転写調節領域）の長さを変えて組み込む、という作業をしたことが複数回あります。インサートの長さ（500bp〜5kbp程度で、500bp区切りとか1kbp区切りとか）だけが違う条件でのライゲーションなわけですが、出てきたコロニーの数が、インサートの長さに応じて綺麗に減弱していったりは全くしませんでした。どれも大量のコロニーが出てきて、長いインサートで特にコロニーの数が減ってる感じもありませんでした。同様の実験をされている方はたくさんいると思うので、そういう方の話も聞けると良いのですが……。 イレギュラーなやり方（インサートを大量に突っ込んで極端にコロニーが減る、は先に書いた通り。あと、3断片ライゲーションとか）でコロニーが減るのは経験ありますが、数kbpのインサートの長さで、はどうかなあ？ > >これがあるから、制限酵素で切って確認する時は繋げるのに使った制限酵素とは別のものを使うこと、インサート内で一箇所ベクター側で一箇所（以上）が基本だ、なんて習ったんですが、 > そらそうですが、２、３百ベースでとなるとそうも行かないでしょう。 そらたしかにいつもいつも基本通りに出来る条件が揃うとは限りませんが、といってやっぱり繋ぐときに使った制限酵素だけを使わなきゃならんということもないし、制限酵素サイトが山ほどあるであろう4bpカッターを使わなきゃならないような条件もそうそうないでしょう。繋ぐときに使った制限酵素の片方と、もう一箇所ベクター内にあるサイトで切れば、大雑把にどのように繋がったかが推測出来るわけですし。 > インサートがそのまま切り出される場合インサートのバンドのインテンシティーが倍になるので、他のポジのクローンなどと比較するとわかるといえばわかります。 これ、理屈の上ではそうなんですが、結構面倒だと思います（面倒でした）。単純に等量(ng）をゲルに流してだと見れない場合の方が多いんじゃないかなあと思いますが、おおさんは実際にこれで比較されたことありますか？

(無題) 削除/引用 No.7441-29 - 2018/12/05 (水) 09:21:42 - クロロホルム クロロホルムの規制は、バイオ系にとってはかなり面倒なんです。 規制対象が（年間）使用液量ではなく使用液の濃度なので、PCIだと微量でもダメだそうです。 1日使用量等で規制免除があると良いのですが。 www.mhlw.go.jp/file/06-Seisakujouhou-11300000-Roudoukijunkyokuanzeneiseibu/0000059137.pdf

(無題) 削除/引用 No.7441-28 - 2018/12/05 (水) 07:27:07 - ligation >[Re:25] クロロホルムさんは書きました : > 日本で2年ほど前？に（量を問わず）クロロホルムを取り扱う従事者に特定健康診断が義務付けられたので、当方はラボの在庫を廃棄しました。 情報ありがとうございます。量を問わずということは、使用量が年に3mLであってでも、ですよね。やっぱり代替手段への移行が楽かなあ、と思います。昔は必須だった技術ではあるけれど、まあ時代の流れですね。

(無題) 削除/引用 No.7441-27 - 2018/12/05 (水) 07:18:29 - おお >2kb、長いでしょうか？正直なところ、自分にとっての長いの定義は10kb以上で、大昔にこの手やり方で6kbと8kbを繋げたこともありますし、2〜3kbでやるのはザラだったので、あまり長いという意識がありません。 実際正攻法でやるにはそんなに苦労するほど長いわけではないとおもいます。でも５００bとかと比べると正攻法でも相対的にTransformationでできるコロニーの数が減る傾向があるのはたしかです。実際数キロの物を覚えたてのときから入れてきましたがある違うラボで日短い物をかなりラフにやってほぼルーティーンで殆どがワークしていて、コロニーの数も多いことがよくあるのをみて、え、そんなんでいいのと思ったことがあります。十数キロぐらいまでは作ったことがありますが、そのへんになるすべての点できっちりやろうという意識が働きます。 >これがあるから、制限酵素で切って確認する時は繋げるのに使った制限酵素とは別のものを使うこと、インサート内で一箇所ベクター側で一箇所（以上）が基本だ、なんて習ったんですが、 そらそうですが、２、３百ベースでとなるとそうも行かないでしょう。もちろん４ベースカッターでバンドがたくさん出ても、インサート内に切れるところがあればやれないこともないですけど。またインサートを切らない外側の制限酵素で切れば入っているものの長さは確認できますね。 ちょっと加えるとタンデムにはいってインサートがそのまま切り出される場合インサートのバンドのインテンシティーが倍になるので、他のポジのクローンなどと比較するとわかるといえばわかります。

(無題) 削除/引用 No.7441-26 - 2018/12/05 (水) 06:21:12 - ligation > PCIが苦手というのはそれほど煩雑な作業でもないのでよくわかりませんけど、やる機会は減っていっているのでしょう。 上におおさん自身が書いて下さった理由で好きじゃないんですよ。5ｍLもゴミが出ないのに、それ用に廃棄ビンを準備するのメンドクサイ、やらずに済む方法無いの？とかラボマネやテクニシャンの方に言われるのはシンドイんです。じゃあ自分でやるから、と言えばそれはそれでまた面倒なことになる場合ありますしね。きちんとフードの中で作業してるのに、それでも匂いに気付いてなんやかや言ってくる同僚がいたりしてもシンドイし（まあ、こういうこと言ってくる人は常に誰に対してもイチャモンつけるところがあって、フェノール自体が問題な訳じゃ無いんですけど）。そういう訳で、自分はやらずに済むならやらないです。 > あとインサートを大過剰いれるてはインサートが比較的短いとき、大量にインサートを用意できるときはまあまあうまくいきます。 >ただ質問主さんのように２kbpとかになると結構難しくなってくるようなきがします。 2kb、長いでしょうか？正直なところ、自分にとっての長いの定義は10kb以上で、大昔にこの手やり方で6kbと8kbを繋げたこともありますし、2〜3kbでやるのはザラだったので、あまり長いという意識がありません。まあ、ここらへんは個人の経験によって違うところですね。ターゲッティングベクターを山ほど作っていた人から言わせると10kbもそんなに長いとは感じないと言っていたし、逆に100bp以上くらいはみな長い気がしてしまうと言っていた人に会ったこともあるし（多分合成オリゴが頭の中にあるから、と言っていた）。 >ただしインサート同士がLigationされるときはたまにタンデムに入ったりします。制限酵素できってもそれが認識できないこともありますので注意が必要なこともあるかと。 これがあるから、制限酵素で切って確認する時は繋げるのに使った制限酵素とは別のものを使うこと、インサート内で一箇所ベクター側で一箇所（以上）が基本だ、なんて習ったんですが、こういうノウハウも新しい技術（in fusionとか）が一般化して受け継がれなくなっていくんですかね。制限酵素サイトを意識しないで済む場面が増えたしなあ。

クロロホルム 削除/引用 No.7441-25 - 2018/12/05 (水) 06:09:45 - クロロホルム 日本で2年ほど前？に（量を問わず）クロロホルムを取り扱う従事者に特定健康診断が義務付けられたので、当方はラボの在庫を廃棄しました。 /www.yobouigaku.jp/images/20141101_organic_solvent_10.pdf 大学等だと化学系のラボが複数あるので特定健康診断もやむを得ないのでしょうが、ウチのような少人数のサテライトラボだとコストの問題で代替手段（カラム法や自作ガラスビーズ法）に移行しました。

(無題) 削除/引用 No.7441-24 - 2018/12/05 (水) 05:28:39 - おお まあPCIはシリカベースのきっとなどで結構置き換えられるようになってきてますし、少量といえど廃棄物として扱わないと行けないのはじじつですし（ほかにどの程度そういう廃棄物が出るかにもよるんだと思います）、極力有機溶媒などが揮発して吸ってしまうのも避けたいというのもあるでしょうし、減っていくのはわかる気がします。 フォスファターゼは失活しやすいとかいろいろな謳い文句の新しい商品が出てきているようですし（評価はさておき）、PCIなくてもいいかなというのもわからなくないです。 PCIが苦手というのはそれほど煩雑な作業でもないのでよくわかりませんけど、やる機会は減っていっているのでしょう。 変性除去という観点からは変性剤を入れた状態でエタ沈すると熱変性しなくてもまあ大丈夫かなとおもいます。例えばSDS、Guanidine、尿素など。電気泳動して切り出してしまうならその必要もないですし。 ま、工夫次第できちっとした形で進めれるものかと思います。 あとインサートを大過剰いれるてはインサートが比較的短いとき、大量にインサートを用意できるときはまあまあうまくいきます。たとえばオリゴをアニーリングして両端が制限酵素にあうように突出している場合、オリゴはオプションを使わない限り必要なところにリン酸がないですから、ベクター側のリン酸に頼ってLigationするとか。ただしインサート同士がLigationされるときはたまにタンデムに入ったりします。制限酵素できってもそれが認識できないこともありますので注意が必要なこともあるかと。ただ質問主さんのように２kbpとかになると結構難しくなってくるようなきがします。というのも正攻法でも長くなれば入りにくくなりますので。ちょっと冒険かなと。

(無題) 削除/引用 No.7441-23 - 2018/12/05 (水) 01:23:00 - ligation >[Re:21] APさんは書きました : > マイクロチューブスケールのPCIなら廃棄物もあまり問題にならないし、基本手技ですから、これが苦手なんて言ってられない。 冗談や煽りで書いていると思われると困るので予め書いておくけれど、以下本気で聞くのですが、基本手技と言いつつ、今ってPCIが常備されているラボって案外に少なくないですか？純粋な生物系なんかだとまた違うのかもしれないけど、少なくとも自分が経験してきた医学部基礎系では常備しているところはなかった。世に言う旧帝大学で特段レベルが低い研究所ってわけでもない。自分がPCIを使いたいと思ったらまずそれを準備するところから始めなくてはいけなくて、使うのは少量だし他のラボから分けてもらおう、と思ったらどこも持ってなくて随分面倒くさかった。今海外にいるけれど、ここでもどこも持ってない（あったけど、調整したのが数年前に誰か知らない人がやった、とかばっかり）。皆さんのラボでは常備してるんでしょうか？ > 脱リン酸化処理をしないで効率が落ちてもやればできる、ってくらいなら失活が完全でないとしてもCIAP後、熱失活処理をしてやったほうがマシな気がする。 このあたりは人によって印象は違うでしょうね。自分はCIAP後の熱失活処理でやったこともあるけれど、インサートの比を変えるやり方の方がはるかにマシだった（運が良かっただけかもしれないだろ、という異論はもちろん認めます）。気がする、ってAPさんは実際に両方でやったことがあった上で仰ってるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7441-22 - 2018/12/04 (火) 12:46:40 - AP あ、それと未消化のcccが残って形質転換のバックグランドを上げるのを避けるため、ベクターを制限酵素消化したあとは、ゲル電気泳動で精製するのをルーチンにしています。こういう手順を踏んでいるなら、AP処理が済んでからゲル電気泳動・切り出しをすれば、エキストラの精製はもちろん不要。

(無題) 削除/引用 No.7441-21 - 2018/12/04 (火) 12:22:40 - AP マイクロチューブスケールのPCIなら廃棄物もあまり問題にならないし、基本手技ですから、これが苦手なんて言ってられない。 AP後の精製が面倒だというなら、いまなら熱で完全に失活できるSAPもある。 多くは未だにCIAPを使っていると思うけど、これも完全失活、不可逆失活は難しくても熱でかなり失活できる。脱リン酸化処理をしないで効率が落ちてもやればできる、ってくらいなら失活が完全でないとしてもCIAP後、熱失活処理をしてやったほうがマシな気がする。簡便性と効率を秤にかけて、あえてCIAP後、熱失活で進むプロトコールやキットもあった記憶がある。

(無題) 削除/引用 No.7441-20 - 2018/12/04 (火) 08:09:07 - ligation 今だと簡単に精製するキットなりカラムなりがあるかもしれないので、以下の話はあまり有用ではないかもしれないが……。 脱リン酸化処理を行う際に使うアルカリフォスファターゼが残留していると、以降のステップ（というかライゲーション反応）を阻害する。従って、AP処理後は、綺麗に精製するステップが必要になる。具体的にはフェノール/クロロフォルムを使ったりとか。これが余り好きではない（完全に綺麗にやろうと思うとどうしても回収率が減るし、ゴミも増えるし）ので、私はこの手のライゲーションは、AP処理はせずに、混ぜるインサートの比を増やすやり方でやってきた。 インサート:ベクター=1:20〜50（たまに100とかでも試しても上手くいった） 要するに、ベクターに対して大量のインサートを入れることで、セルフライゲーションよりも正しいライゲーションが起こる確率の方が高くなることを狙ったもの。出て来るコロニーの数は極端に減るけれど、当りコロニーの割合は高く、このやり方で問題になったことは無い。イレギュラーなやり方なのであまり他人に勧めてはいけないのかもしれないが、同じやり方をしている人の話をこの掲示板で見たことがあった（ような気がする）ので、それほど変なやり方ではないのかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.7441-19 - 2018/12/04 (火) 03:54:53 - おお ＞SalI/XhoIならセルフライゲーションは避けにくいです。SalIは切れにくいし、、、cohensiveだから、、、 セルフ避けるために脱リン酸化するのですけど、、、 プラスミドから切り出すのならSalIはそんなにやりにくい酵素ではないと思います。高い塩濃度を要求するので他との相性はありますけど。

セルフライゲーションは避けにくい 削除/引用 No.7441-18 - 2018/12/03 (月) 06:19:49 - そっと SalI/XhoIならセルフライゲーションは避けにくいです。SalIは切れにくいし、、、cohensiveだから、、、 サイトを変えるのが、賢明と思います。 エレクトロポレーションは一見効率が良いですが、拾うコロニー数を考えれば、普通のコンピタント（井上法）でほとんどできるはず。

(無題) 削除/引用 No.7441-17 - 2018/11/30 (金) 19:41:50 - Ca 皆様ご意見やご指摘誠にありがとうございました。 皆様のご指摘の通り、脱リン酸化処理を行ってからベクター入れ替えを行うことにします。

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