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(無題) 削除/引用 No.8879-3 - 2020/06/01 (月) 02:11:48 - おお PCRの酵素を変えてみてください。 ベタインなどの添加が有効な事があります。 タッチダウンなどの方法論が有効な場合があります。

(無題) 削除/引用 No.8879-2 - 2020/06/01 (月) 01:37:22 - 住野 すみません、追記です。 使用しているPCR酵素は他のクローニングで使用しているため、酵素がへたっているわけではなさそうです。 変異導入は一アミノ酸置換を行う目的なので1ないし2塩基を変えることを目的としています。

site directed mutagenesisにて増幅されません。 削除/引用 No.8879-1 - 2020/06/01 (月) 01:35:56 - 住野 質問させください。 site directed mutagenesisがうまくいきません。 私はAgilentのホームページにある変異導入用プライマーデザインから設計したプライマーを使って、Pfu Ultra IIを用いて鋳型プラスミドを元にPCR反応をさせました。 鋳型は10 ngと50 ngを用い、site directed mutagenesisで少々多いですが25サイクル回し、アガロースゲル泳動で確認をすると全く増幅されていませんでした。 鋳型プラスミドのサイズは9000 bpでpcDNA3.1+ベースのものを使用しています。 PCR反応条件は、95度2分ー95度0.5分/50度1分/72度5-10分ー72度5分/12度を試しました。 ここのフォーラムの過去のものを辿り、2ステップPCRも試しました。 PCR反応条件は、95度2分ー98度10秒/68度5-10分ー72度5分/12度です。 どちらも増幅産物が見られませんでした。 ただ、PCRダイマーと思われるバンドが使用したプライマー量以上のものが見られたため、プライマーダイマーが増幅しているようでした。 site directed mutagenesisに使用するプライマーがダイマーを生じてしまうことは仕方のないことだとは思いますが、これまで多くの変異体を同様な方法で作っていたので実験が進まずとても苦しいです。 間違っているところ、改善すべきところがありましたら、どうかご教示いただけませんでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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